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       【摘要】 
       目的考察不同厂家生产的虫草菌丝体化学成分的一致性。方法对应用蝙蝠蛾拟青霉菌和中华被毛孢菌发酵的不同厂家的6个产品的腺苷和多糖的含量，水提取液的HPLC指纹图谱进行了考察。结果不同菌株发酵的虫草菌丝体中腺苷和粗多糖的含量存在差异，但蝙蝠蛾拟青霉菌和中华被毛孢菌两种菌种之间发酵产物腺苷和粗多糖的含量未见明显差异； 不同菌株的蝙蝠蛾拟青霉菌发酵产物非常相似，不同菌株的中华被毛孢菌发酵产物也很相似，但蝙蝠蛾拟青霉菌和中华被毛孢菌两种菌种之间发酵产物明显不同。结论结果揭示可以用HPLC指纹图谱的方法对市场中的虫草菌丝体进行鉴定，明确其是否为国家批准使用的蝙蝠蛾拟青霉菌或中华被毛孢菌发酵获得。
       【关键词】  冬虫夏草; 蝙蝠蛾拟青霉菌; 中华被毛孢菌; 高效液相色谱指纹图谱
       Chemical Analysis of the Commercial Liquid Fermentation Products from Different Cordyceps Species and Strains
       WU Yingchun, WU Ximin, PAN Yifeng,LI Yiming
       1. Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, Shanghai 201203, China; 2. Shanghai Modern TCM Technical Developing Company, Shanghai 200051, China
       Abstract：ObjectiveTo investigate the chemical difference of commercial fermentation mycelium from different strains. MethodsAdenosine, polysaccharide contents and HPLC fingerprints in 6 samples of fermentation mycelium from different strains of species Paecilomyces hepiali and Hirsutella sinensis were analyzed.ResultsThe result showed that although there was a little difference of adenosine and polysaccharide contents among different fermentation products, the adenosine and polysaccharide contents were not caused by the species difference. The HPLC fingerprints of different commercial fermentations from the same strain were almost the same. There was, however, obvious difference between the commercial fermentations and the different species. ConclusionIt is convenient to identify a commercial products obstained from Paecilomyces hepialid or Hirsutella sinensis with HPLC fingerprints. 
       Key words：Cordyceps;   Paecilomyces hepialid;   Hirsutella sinensis;   HPLC fingerprints
       
       冬虫夏草Cordyceps sinensis(Berk．)Sacc．为麦角菌科真菌寄生在蝙蝠蛾科昆虫虫草蝙蝠蛾幼虫上的子座及幼虫尸体的复合体［1］，其性平，味甘，入肺、肾经，具有益精髓、补虚损、保肺、益肾、止血、化痰等功效，主要用于虚劳咳嗽、咯血盗汗、阳痿遗精、腰膝酸软等症。现代药理证明冬虫夏草具有扩张支气管、控制心率、镇静催眠、雄激素样等作用，还具有抗癌活性和抑制病菌、提高机体免疫功能等作用，是我国传统滋补强壮的名贵中药［2］，在中成药和保健品中大量使用。随着天然虫草在市场上应用的日益广泛和无序的疯狂采挖，天然虫草的资源正迅速枯竭。
        
       我国在20世纪80年代初已经开始了人工培养冬虫夏草菌丝体的研究工作，并取得了很大进展。国家卫生部自1987年来陆续批准了“宁心宝胶囊”(治疗心律失常)、“金水宝胶囊”(治疗性功能底下、高脂血症、慢性支气管炎等)及“至灵胶囊”(治疗慢性肾功能不全、慢性肾炎、慢性乙肝等)等冬虫夏草制剂用于临床［3，4］。
        
       人工发酵虫草菌丝体主要来源于天然冬虫夏草中提取分离得到的真菌成分。至今，微生物学者报道从天然虫草中提取分离和鉴定的真菌菌株多达十余种，如菌株 1 Mortierella hepiali Chen & Liu (1979)，菌株 2 Stachybotrys sp. Kobayasi (1982), 菌株3 Paecilomyces hepiali Chen & Dai (1983)，菌株4 Paecilomyces sinensis Chen (1984)，菌株5 Cephlosporium sinensis Chen (1985)，菌株6 Cephlosporium dongchongxiacao Chen (1985)，菌株7 Scytalium sp. (1985)，菌株8 Scytalidium heliali Li (1988)，菌株9 Tolypocladium sinensis Li (1988)，菌株10Hirsutella sinensis Liu, Guo, Yu & Zeng (1989)，菌株11 Hirsutella hepiali Chen & Shen (1989)，菌株12 Synnematium sinensis Yin & Shen (1990)，菌株13 Chrysosporium sinensis Liang (1990)。其中有些菌种经后期的重新鉴定，其实为同一菌种，如菌株10，11，12均为菌种Hirsutella sinensis。 目前国家批准应用蝙蝠蛾拟青霉菌（Paecilomyces hepiali）和中华被毛孢菌（Hirsutella sinensis）发酵产物作为人工发酵的虫草菌丝体在中成药和保健食品中使用，但商品名不得冠以冬虫夏草。
        
       液体发酵虫草菌丝体的工艺目前已成熟，国内有多个厂家从事虫草菌丝体的生产。由于从冬虫夏草中获得的菌种来源不同，命名又较为混乱，加上菌株在发酵过程中存在变异，为考察不同厂家生产的虫草菌丝体化学成分的一致性， 本文对应用蝙蝠蛾拟青霉菌和中华被毛孢菌发酵的不同厂家的产品的腺苷和多糖的含量、水提取液的HPLC指纹图谱进行了考察。
       1  仪器与试剂
       1.1  仪器
       Aglient 1100型高效液相色谱仪（ChemStation 工作站， G1316A柱温箱、G1322A在线脱气机、G1311A四元泵），紫外检测器(G1314B ); Pharmacia C-18 (4.6 mm×250 mm, 5 μm) 色谱柱。 751分光光度计，上海分析仪器厂生产 。
       1.2 试剂
       腺苷（上海生工生物工程公司）、葡萄糖（国药集团化学试剂厂），其他试剂均为色谱纯或分析纯。虫草菌丝体样品: 分别购自浙江和江西的液体发酵蝙蝠蛾拟青霉菌（Paecilomyces hepiali）菌丝体样品3个，命名为PH-1、PH-2和PH-3。分别购自浙江、江苏、山东的液体发酵中华被毛孢菌（Hirsutella sinensis）菌丝体样品3个，命名为HS-1、HS-2和HS-3。
       2  方法与结果
       2.1  腺苷的含量测定［5］
       2.1.1  对照品溶液的制备取腺苷对照品适量，用90％ 甲醇配成1 mg·ml-1 的对照品溶液。
       2.1.2  供试品溶液的制备取样品粗粉1 g，加90％ 甲醇40 ml，加热回流30 min，过滤，滤液浓缩至干，残渣以90％ 甲醇1 ml使溶解，作为供试品溶液。
       2.1.3  色谱条件Pharmacia C-l8 (4．6 mm×250 mm, 5 μm)为固定相，磷酸盐缓冲液0.01 mol·ml-1 (pH 6.5)-甲醇(17∶3)为流动相，流速1.0 ml·min-1，检测波长为280 nm。
       2.1.4  标准曲线制定精密称取适量腺苷标准品50 mg，置25 ml容量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀。精密量取0.1，1.0，2.0，4.0，6.0，8.0 ml置25 ml量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀, 进样20 μl，测得峰面积，以腺苷浓度为横标，腺苷峰面积为纵坐标，求得线性回归程为：Y=1.657×10-3X+0.045， r=0.999 1，结果表明腺苷在0.008 ～0.64 mg·ml-1 内线性关系良好。
       2.1.5  精密度实验分别取浓度为0.16 ，0.32 mg·ml-1 的腺苷标准品溶液，重复进样5次，20 μl/次，对照品峰面积积分值的RSD 为0.33% 和0.17%。表明方法精密度良好。
       2.1.6  稳定性实验取浓度为 0.32 mg·ml-1的腺苷标准品溶液，在0，2，4，6，12 h分别进样20 μl，记录峰面积，结果5次进样腺苷峰面积积分值RSD为0.75%。表明样品溶液室温放置12 h内稳定性良好。
       2.1.7  重复性实验取同批腺苷标准品，按“2.1.8”项下配制供试品溶液5份，分别进样20 μl，记录色谱图，计算峰面积的RSD为0.67%，表明方法重复性良好。
       2.1.8  含量测定分别取6个虫草菌丝体药材粉末约0.5 g，精密称定，置圆底烧瓶中，加90％ 甲醇水溶液10 ml， 加热回流30 min，放冷，滤过，滤渣再加90％甲醇水溶液10 ml， 加热回流30 min，滤过，合并2次滤液，置25 mL容量瓶中，续补90％甲醇水溶液至刻度。分别进样20 μl，按上述色谱条件测定，外标一点法计算含量。
        
       结果6个样品PH-1，PH-2，PH-3，HS-1，HS-2，HS-3 中所含腺苷的含量（%）依次为 0.16，0.21，0.15，0.23，0.16，0.10。
       2.2 虫草粗多糖的含量测定［6］
       2.2.1 标准曲线制定精密称取葡萄糖标准品5 mg，置于100 ml容量瓶中，加入蒸馏水定容至刻度。分别精密吸取上述葡萄糖标准液0，0.4，0.7，1.0，1.3，1.6，2.0 ml于试管中，均精确补充蒸馏水至2.0 ml，分别加入5% 苯酚试液1.0 ml，摇匀，再加入浓硫酸5.0 ml， 立即用旋涡混合器混匀，室温放置30 min后， 以标准液0 ml为空白，于490 nm处测定吸收值（D）。根据标准液浓度（C，mg·L-1）及吸收值可得回归方程式 D = 0.054 5 C+ 0.057 3，r=0.998。
       2.2.2  样品制备
       精密称取冬虫夏草菌粉5 g，加蒸馏水约40倍，煮沸1 h，滤纸过滤收集滤液。滤渣再加约40倍蒸馏水煮沸1 h，收集滤液，重复2次。将3次滤液合并，浓缩至小体积，加入4倍量无水乙醇，4℃冰箱放置过夜，过滤，沉淀用纯水溶解后定容至500 ml，此为虫草粗多糖提取液样品。
       2.2.3  粗多糖含量测定与提取率计算各吸取1 ml粗多糖样品溶液，加入1  ml蒸馏水稀释，按标准曲线操作步骤测定光密度，以标准曲线计算虫草粗多糖的含量。
        
       结果6个样品PH-1，PH-2，PH-3，HS-1，HS-2，HS-3中所含粗多糖的含量（%）依次为 5.9，7.3，5.2，6.3，5.7，7.8。 
        
       粗多糖含量（%）=根据标准曲线计算量×稀释倍数样品质量×100%
       2.3  HPLC指纹图谱比较
       2.3.1  供试品溶液的制备取样品粗粉0.5 g，加水40 ml，摇匀，加热回流30 min，滤过，滤液加水定溶至50，作为供试品溶液。
       2.3.2  色谱条件Pharmacia C-8 (4．6 mm×150 mm, 5μm)为固定相， 流动相为乙腈-水梯度洗脱(0～5 min, 5～35%乙腈; 5～20 min, 35～60%乙腈; 20～25 min, 60～90%乙腈), 流速1.0 ml·min-1，检测波长为230 nm。结果见图1～2。
       3  讨论
           
       从实验结果看出，不同菌株发酵的虫草菌丝体中腺苷和粗多糖的含量存在差异，但蝙蝠蛾拟青霉菌和中华被毛孢菌两种菌种之间发酵产物腺苷和粗多糖的含量未见明显差异。由于 收集的各菌株发酵菌丝体批号有限，未能对同一菌株各批次发酵物的差异进行观察。
       通过HPLC指纹图谱看出，3个不同菌株的蝙蝠蛾拟青霉菌发酵产物非常相似，3个不同菌株的中华被毛孢菌发酵产物也很相似，但蝙蝠蛾拟青霉菌和中华被毛孢菌两种菌种之间发酵产物明显不同。此结果揭示可以用HPLC指纹图谱的方法对市场中的虫草菌丝体进行鉴定，明确它是否是由国家批准使用的蝙蝠蛾拟青霉菌或中华被毛孢菌发酵获得。
       【参考文献】
         　　［1］郑汉臣, 蔡少青. 药用植物学与生药学, 第4版［M］. 北京: 人民卫生出版社, 2003: 34.
       
       ［2］赵余庆, 于 明, 陈立君, 等.冬虫夏草属真菌化学研究概况［J］.中草药，1999, 30(12):950.
       
       ［3］扬朝宽, 侯淑彦, 于 静, 等. 宁心宝胶囊治疗心律失常［J］. 中国新药与临床杂志，1999, 9(5): 279.
       
       ［4］张敏和, 洪 量, 郭 群.高效液相色谱法测定发酵虫草菌粉和金水宝胶囊中腺苷的含量［J］.中草药，1994, 25(2): 77.
       
       ［5］国家药典委员会.中国药典，Ⅰ部［S］. 北京：化学工业出版社，2005: 485.
       
       ［6］Kim H O. A comparative study on the production of exopolysaccharides between two ntomopathogenic fungi Cordyceps militaris and Cordyceps sinensis in submerged mycelial cultures［J］. Journal of Applied Microbiology, 2005, 99: 728.