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       【摘要】 
       目的研究川芎嗪对氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL) 致人内皮细胞ECV304 损伤的保护作用及机制，探讨其在动脉粥样硬化防治中的意义。方法ox-LDL诱导人血管内皮细胞损伤，以0.5 mg/ml川芎嗪干预24 h，试剂盒测定细胞培养液中乳酸脱氢酶（LDH)、丙二醛（MDA)含量以及细胞中超氧化物歧化酶(SOD) 、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）活性。结果川芎嗪对ox-LDL诱导的血管内皮细胞诱导的损伤有明显的抑制作用，主要是显著提高了血管内皮细胞抗氧化酶SOD 、GSH-Px的活性。结论川芎嗪对ox-LDL导致內皮细胞损伤具有保护作用，机制与其抗氧化效应有关。
       【关键词】  川芎嗪； 氧化型低密度脂蛋白； 动脉粥样硬化； 谷光甘肽过氧化物酶； 超氧化物歧化酶
          内皮功能不全被认为是动脉粥样硬化(atherosclerosis，AS) 炎症学说发病机制中的最早期事件。许多危险因素能引起内皮功能不全，诸如高胆固醇血症、高血压病、吸烟、糖尿病等［1］。但内皮功能不全的确切机制还不十分清楚。越来越多的证据显示氧化型低密度脂蛋白(oxidized low density lipoprotein, ox-LDL) 在内皮功能不全中扮演重要角色。本实验以体外培养内皮细胞为研究对象，观察川芎嗪对ox-LDL诱导的内皮细胞损伤的保护作用及其机制，为川芎嗪在治疗动脉粥样硬化中的应用提供实验依据。
       1  材料与仪器
       1. 1  药物盐酸川芎嗪氯化钠溶液（100 ml∶80 mg），购于山东华鲁制药有限公司，用蒸馏水稀释成终浓度0.5 mg/ml。
       1.2  细胞人内皮细胞株( ECV304) 购自武汉大学典藏中心。
       1.3  试剂与仪器DMEM，胎牛血清以及胰蛋白酶购自美国Gibeco公司；乳酸脱氢酶（LDH)、丙二醛（MDA)，超氧化物歧化酶(SOD) 、谷光甘肽过氧化物酶(GSH-Px) 检测试剂盒均购于南京建成公司。兔抗人Ⅷ因子抗体购于福州迈新生物技术公司。
       2  方法
       2.1  内皮细胞培养和鉴定
       常规培养ECV304细胞，待生长至融合状态后，0.25%胰蛋白酶消化，吹散、均匀接种于预置盖玻片的6孔板中，加入细胞培养液，置孵箱培养24 h取出细胞爬片。PBS洗涤两次，4％多聚甲醛固定后，细胞的鉴定采用Ⅷ因子抗原检测法、DAB染色阳性确定。
       2.2  ox-LDL 的制备参照文献［2］
       分离出人血浆LDL，4 ℃置磷酸缓冲盐透析24 h，经琼脂糖凝胶电泳证实为单一区带。所得LDL经聚乙二醇(PEG) 20000浓缩4～5 倍后以Lowry"s法测定蛋白含量。0 .45 μmol/ L 滤膜过滤除菌。采用CuCl2 在室温下氧化。测定各组硫代巴比妥酸反应产物（TBARS）值，经0. 4 %的琼脂糖凝胶电泳检测 LDL氧化程度。
       2.3  实验分组测定其它指标的细胞，无血清培养基同步化12 h，随机分为４组：① 空白对照组（ECV304）：不加任何刺激因素；②川芎嗪对照组（ECV304＋川芎嗪）：加入终浓度为0.5 mg/ml的川芎嗪；③ox-LDL组（ECV304+ox-LDL）加入终浓度为0.1 mg/ml的ox-LDL；④川芎嗪保护组（ECV304+ox-LDL+川芎嗪）加入终浓度为0.1 mg/ml的ox-LDL和0.5 mg/ml的川芎嗪。各组细胞加入处理因素后继续培养24 h，收集细胞培养液，测定LDH、MDA含量；收集细胞检测SOD 、GSH-Px活性。
       2.4  测定LDH、MDA 含量以及SOD、GSH-Px活性收集12 孔培养板中培养液，按照试剂盒说明书测定LDH 和 MDA含量；培养板中细胞用PBS洗2次，刮取细胞，加入冰冷PBS悬浮细胞，超声15 s，反复冻融3次，离心，按照试剂盒方法测定SOD、GSH-Px活性。
       3  结果
       3. 1  内皮细胞第Ⅷ因子相关抗原免疫组化鉴定  细胞呈椭圆形，多角形或不规则形，胞浆中有黄褐色颗粒存在，Ⅷ因子相关抗原鉴定反应阳性。
       3.2  川芎嗪对ox-LDL 诱导内皮细胞损伤的保护作用细胞培养液中LDH检测表明：经ox-LDL刺激24 h后细胞分泌的LDH含量（468.34±9.46 ）U/L，明显高于未加任何处理因素的空白组（136.56±19.26）U/L。而经过终浓度为0.5 mg/ml的川芎嗪处理的药物保护组细胞分泌的LDH含量为（75.34±6.89）U/L，明显低于ox-LDL组，两者差异显著（P<0.05）。川芎嗪保护组较ox-LDL组MDA含量明显降低，差异有显著性（P<0.05 ），其中ox-LDL组MDA为（1.58±0.02） μmol/L，而川芎嗪保护组MDA为（ 0.64±0.08 ）μmol/L；同时川芎嗪保护组的SOD、GSH-Px活性明显高于ox-LDL组，ox-LDL组SOD为（27.43±5.43）mU/ L，GSH-Px为（74.43±6.39）kU/0.1L；川芎嗪保护组SOD为（40.43±6.52）mU/ L，GSH-Px（125.63±4.67）kU/ 0.1 L，两组差异显著（P<0.05）。结果见表1。表1  川芎嗪对ox-LDL诱导内皮细胞损伤的保护作用（略）
       4  讨论
        内皮细胞功能障碍是AS 始发事件，而ox-LDL是目前公认的致内皮细胞损伤的危险性因子之一。临床上发现急性心肌梗塞患者血浆ox-LDL 水平明显高于心绞痛患者和对照组，但三者之间的脂质水平无差异［3］。Toshima 等发现冠心病(coronary heart disease，CHD) 患者血浆ox-LDL 水平较对照组明显为高，该水平独立于其它危险因素之外［4］。ox-LDL直接损伤内皮细胞，破坏其完整性，增加细胞死亡率。川芎嗪作为一种抗氧化作用机理抗动脉粥样硬化越来越受到重视［5］。LDH 和MDA是一种细胞内的酶，广泛存在于细胞浆内，当细胞破坏或细胞膜通透性增加时，其水平均明显增高，可反映细胞或细胞膜损伤的程度［6］。ox-LDL作用于内皮细胞24h后促进细胞膜脂质过氧化和胞膜损伤，ox-LDL组LDH、MDA含量明显升高，而川芎嗪可使ox-LDL 损伤细胞的LDH、MDA含量明显降低，说明川芎嗪通过清除氧自由基，达到修复和保护作用细胞膜的完整性的作用。
         
       高脂蛋白环境可使机体产生大量自由基，生物膜上的不饱和脂肪酸受活性氧作用，产生大量脂质过氧化物，使生物膜结构和功能改变，从而造成组织细胞的损伤。在保护细胞免受或减轻活性氧损伤的过程中，细胞内SOD和GSH-Px等具有抗氧化功能的酶起着不可忽视的作用［7］。SOD催化超氧根阴离子生成H2O2和O2，GSH-Px可将H2O2和过氧化物还原为H2O或相应无毒的醇。本结果证实, ox-LDL组细胞内SOD和GSH活性较空白对照组降低，川芎嗪保护组细胞内SOD和GSH-Px活性比ox-LDL组显著提高，可见川芎嗪具有保护细胞内SOD和GSH-Px活性的作用，从而增强ECV304细胞自身抗氧化能力。综上所述，川芎嗪可能是通过保护ECV304细胞内SOD和GSH-Px活性从而保护内皮细胞免于ox-LDL造成的损伤。川芎嗪作为抗氧化的中药在动脉粥样硬化的临床治疗上有着广阔的前景。
       【参考文献】
         　　［1］康奕飞， 何兆初， 吴竣，等. PPAR-α激动剂对大鼠内皮功能不全的作用及机制探讨［J］. 医学理论与实践，2008，21 (6) :621.
       
       ［2］Wang Chunben, Zong Yiqiang, Wu Wangsheng, et al.Rapid isolation of large amount of plasma VLDL and LDL by a two step ultracentrifugation［J］. Acta Univ Med Tongji ,1995，24 (3) :169.
       
       ［3］Fuhrman B, Partoush A, Aviram M. Acetylcholine es2 terase protect s LDL against oxidation［J］. Biochem Biophys Res Commun ,2004，322 (3) :974.
       
       ［4］秦英，杨君，朱陵群，等. 氧化低密度脂蛋白对人血管内皮细胞ECV2304促增殖及诱导凋亡的作用［J］. 中国病理生理杂志, 2003，19 (3) :334.
       
       ［5］霍伟琪. 中药治疗动脉粥样硬化作用的研究进展［J］. 中医药导报，2005，11 :64.
       
       ［6］蒋冠南，申锦林，覃 丽，等. 冰黄液对大鼠急性脑出血作用的研究［J］. 中药药理与临床，2005，21 (6) :74.
       
       ［7］邓暑芳，李素云，贺性鹏. 甲基叔丁基醚对胎鼠脑组织MDA、SOD及GSH的影响［J］. 南华大学学报（医学版），2007，35 (1) :7.