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       【摘要】 
       目的建立大戟属植物中大戟醇(euphol)的高效液相色谱(HPLC)含量测定方法采用RP-C18色谱柱，以乙腈为流动相，流速1.0 ml/min，检测波长为217 nm。 结果进样量在0.58～7μg范围内有良好的线性关系，r=0.999 5；平均加样回收率为99.93%，RSD为2.18%(n=5)。结论该法简便准确、灵敏度高、重现性好，可用于大戟属植物中大戟醇的含量测定。
       【关键词】  高效液相色谱法； 大戟属； 大戟醇
       Determination of Euphol in Four Species of Genus Euphorbia by HPLC
       GAO Yu,LIANG Qiaoli,DAI Chuanchao,WU Qinan,CAO Jianguo,JIANG Jihong
       1.School of Pharmacology,Nanjing University of Traditional Chinese Medicine,Nanjing 210046,China；2.School of Life Science,Nanjing Normal University,Nanjing 210097,China；3.Key Laboratory of Biotechnology for Medicinal Plants of Jiangsu Province,Xuzhou Normal University,Xuzhou 221116,China
       Abstract：ObjectiveTo establish an RP-HPLC method for the determination of euphol in the plant of Euphorbia Linn.MethodsA chromatographic column of Diamonsil-C18 (C18,4.6mm×250mm,5.0μm) was used.The mobile phase consisted of acetonitri.The flow rate was 1.0 ml/min with UV detection wavelength at 217 nm.ResultsA good linearity was obtained with the correlation coefficient ranged of 0.58～7μg (R=0.999 5).The average recovery was 99.93%, RSD=2.18%(n=5)ConclusionThe method is simple,accurate,sensitive and well repeated.It can be widely applied to determine the content of euphol in the plants of Euphorbia Linn.
       Key words： HPLC;  Euphorbia;  Euphol
       
       大戟属Euphorbia Linn是大戟科（Euphorbiaceae）中最大的一个属，全世界有二千余种，我国有八十多种，且新种仍在被发现。该属植物有重要的药用价值，民间用于通便、利尿、治疗水肿、结核、牛皮癣、疥疮和无名肿毒、抗肿瘤等，其化学成分主要有二萜、三萜、黄酮和鞣质等［1］。近些年大戟属植物化学成分含量分析研究报道主要有：用分光光度法测定狼毒大戟水提物中总黄酮含量［2］，以及利用GC-MS测定甘遂中三萜化合物大戟醇（euphol）和tirucallol的含量等［3］。大戟醇是大戟属植物的特征性成分，文献报道许多大戟属植物都含有大量的大戟醇，而用HPLC法测定大戟属植物中大戟醇的含量未见报道。本实验利用从京大戟Euphorbia pekinensis Rupr.干燥根中分离纯化得到的大戟醇为标准品，首次建立了测定大戟醇(euphol)的HPLC法,并用建立的分析方法测定了大戟属4种植物京大戟、狼毒大戟、月腺大戟和甘遂中大戟醇的含量的方法，可用于大戟属植物中大戟醇的含量测定。
       1  仪器与材料
       美国Waters公司高效液相色谱仪(Waters 515型泵，Waters 2996 PAD检测器，Waters Empower色谱工作站，Waters色谱柱恒温箱，Waters 717型自动进样器)。Sartorious型1/10万电子分析天平(北京赛多利斯仪器有限公司)。KQ-500B超声波清洗器(昆山超声仪器有限公司)。
        
       大戟醇(euphol)对照品由本实验室自制，结构经波谱鉴定，经HPLC法测定纯度大于98%。乙腈、甲醇为HPLC级(美国Tedia公司)，水为娃哈哈纯净水，其余试剂为分析纯。京大戟药材采自南京郊区，经巢建国教授鉴定为Euphorbia pekinensis Rupr.的新鲜根，洗净晒干用，狼毒大戟采自黑龙江齐齐哈尔郊区，经本校药用植物教研室巢建国教授鉴定为Euphorbia fischeriana Steud.的新鲜根，洗净晒干用；月腺大戟药材采自南京郊区，经的巢建国教授鉴定为Euphorbia ebracteolata Hayata.的新鲜根，洗净晒干用；甘遂购自安徽药材市场，经巢建国教授鉴定为Euphorbia kansui T.N.Liou ex T.P.Wang的干燥块根。
       2  方法与结果
       2.1  色谱条件Diamonsil-C18色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流动相为乙腈；流速1.0 ml·min-1；柱温30℃；检测波长217 nm。
       2.2  对照品溶液的制备精密称定大戟醇对照品适量，用甲醇溶解，定容，制成0.28 mg·ml-1的对照品溶液。
       2.3  供试品溶液的制备4种药材粉末(过60目筛) 于烘箱中(60℃)干燥至恒重，各取0.5 g精密称定，置50 ml具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25 ml，称重，超声提取30 min，放至室温，再称重，用甲醇补足减失的重量，摇匀，过滤，弃去初滤液，取续滤液用0.45 μm微孔滤膜过滤即为供试品溶液，备用。
       2.4  线性关系考察取上述对照品溶液以不同体积进样分析，分别为2，4，10，20，25 μl。记录各自峰面积，以峰面积(Y)对进样量(X,μg)进行线性回归分析，得回归方程为Y =110 046X－54 607，r=0.999 5，表明大戟醇进样量在0.58～7μg与峰面积呈良好线性关系，色谱图见图1。
       2.5  精密度实验取对照品溶液按上述色谱条件连续进样5次，每次10 μl，结果大戟醇峰面积的RSD为0.94%，精密度良好。
       2.6  稳定性实验取供试品溶液分别在0，1，2，4，8，12，24，48 h进样10 μl，在上述色谱条件下测定，大戟醇峰面积的RSD为1.43%，表明样品溶液在48 h内性质稳定。
       2.7  重复性试验精密称取药材粉末0.5 g，称取5份，按“2.3”项下操作制备供试液，进样10 μl，根据峰面积计算含量。结果大戟醇含量的RSD为1.5% (n=5)。
       2.8  加样回收实验称取同一已知含量的京大戟药材粉末5份，每份约0.5 g，每份精密加入一定量的大戟醇对照品，按“2.3”项下操作制备供试液，取供试液，进样10 μl，在上述色谱条件下测定，计算回收率。结果见表1。表1  回收率实验结果（略）
       2.9  样品测定按“2.3”项下方法制备供试品溶液，取10μl，进样，按“2.1”项下色谱条件测定大戟醇的含量。结果见表2。代表性色谱图见图1。表2  供试品中大戟醇测定结果（略）
       3  讨论
       3.1  提取条件的选择以京大戟为代表性中药，根据测定目标化合物大戟醇的理化性质，分别考察提取溶媒(90%甲醇、80%甲醇、甲醇)、提取方式(冷浸、热回流、超声提取)、溶剂量、提取时间、提取次数，确定最佳提取条件为：以50倍量甲醇超声提取1次，提取时间为30min。此方法简便易行，测定时干扰少。3.2  分离条件的选择分析HPLC二极管阵列紫外全波长扫描图谱以及参考对照品的紫外光谱，确定217 nm为大戟醇吸收峰的检测波长，考察了3种色谱柱：①Diamonsil-C18色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；②AichromBond-1 C18色谱柱(4.6 mm×150 mm，5 μm)；③Zorbax Extend-C18色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；3种流动相：①乙腈-水(90∶10)；②乙腈；③甲醇，进行系统适用性试验，试验结果表明：在色谱条件Diamonsil-C18色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，乙腈为流动相，流速1.0 ml·min-1，柱温为30℃，供试品中大戟醇得到较好分离，理论塔板数不低于4 000，且分析时间较短。
       3.3  4种大戟属植物中大戟醇含量的测定从表2中可以看出，4种植物中大戟醇的含量差异很大，其中京大戟中含量最高。已有文献报道，大戟醇可以显著抑制炎性渗出增加及炎症组织中TNFα、IL-6和IL-1等炎症介质的释放而具有明显的抗炎作用［4,5］；大戟醇对十四烷酰佛波醇乙酸酯激活的爱-巴病毒早期抗原有强抑制作用，使含有该病毒的培养液中的Raji细胞保持很高的存活率［6］；此外，大戟醇还可以抑制犬血管平滑肌细胞的增殖，可能具有一定的抗动脉粥样硬化活性［7］；大戟醇通过扩张外周血管平滑肌表现有明显的降压活性［8］。大戟的药效是否与大戟醇的含量有关，还有待于进一步深入的研究。
       
       本研究用简单快捷的方法测定了4种大戟属植物中大戟醇的含量，它将为大戟醇的分离纯化及其药理作用的深入研究提供实验依据，也为含大戟醇中药的开发和利用提供了一种新的思路。
       【参考文献】
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