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       【摘要】 
       目的建立高效毛细管电泳法（HPCE）分析大蒜多糖中的单糖组成及摩尔比。方法大蒜多糖样品经2 mol/L硫酸降解为单糖后，经1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮( PMP)衍生化，用毛细管区带电泳(CZE)法测定单糖组成。结果大蒜多糖中葡萄糖（Glc）、半乳糖醛酸（GalUA）、鼠李糖（Rha）、甘露糖（Man）、阿拉伯糖（Arab）、葡萄糖醛酸（GlcUA）、半乳糖（Gal）的摩尔比为18.4∶6.99∶4.21∶4.38∶3.15∶7.21∶4.99。结论该方法灵敏度高，结果准确可靠，可用于大蒜多糖的单糖组成测定及质量控制。
       【关键词】  大蒜多糖； 衍生化； 1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮； 毛细管电泳法
        大蒜(Allium sativum)营养丰富，是日常生活中常用的香辛蔬菜和调味佳品，而且具有很强的防病治病保健功能［1］。大蒜多糖为大蒜中一类含量较高的活性组分，药理研究证明大蒜多糖具有抗氧化、抗病毒、保护心肌、防止心肌纤维化等多种重要的生物活性［2，3］，虽然大量文献报道了大蒜多糖的提取分离及药理作用，但关于大蒜多糖的单糖组分研究未见报道。
        高效毛细管电泳法［4，5］是近年发展起来的一种具有高效、灵敏和低耗的分析方法，已引起药物分析界的广泛重视。本实验首次采用柱前衍生化方法，用毛细管电泳法研究大蒜多糖的单糖组成，以期为大蒜资源的开发和利用提供基础依据。
       1  仪器与试药
          
       Beckman P/ACETM MDQ型高效毛细管电泳仪（Beckman公司，美国），二极管阵列检测器，石英毛细管柱（58.5 cm×75 μm，有效长度48.5 cm，河北永年）；FE20-pH计（METTLER TOLEDO公司）；XS205 电子天平（METTLER TOLEDO）。
        葡萄糖(glucose)、甘露糖(mannose)、半乳糖(galactose)、鼠李糖(rhamnose)、阿拉伯糖(arabonose)(分析纯，上海试剂二厂)；葡萄糖醛酸(glucuronic)和半乳糖醛酸(galacturonic acid，分析纯，Sigma公司)；大蒜多糖由新疆埃乐欣药业分离纯化。
       1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)（分析纯，上海试剂二厂）；乙腈，甲醇，色谱纯；硫酸（H2SO4），盐酸（HCl），氢氧化钠（NaOH）(分析纯，西安化学试剂厂)；水为去离子水。
       2  方法与结果
       2.1  电泳条件石英毛细管柱（58.5 cm×75 μm，有效长度48.5 cm）；运行缓冲液：75 mmol·L-1硼砂溶液（pH=10.50）；柱温25℃；电压：15 kV；压力进样0.5 Pa×20 s；检测波长245 nm。清洗程序：第1次进样前分别以甲醇、双蒸水、0.1 mol/L盐酸、双蒸水、0.1 mol/L NaOH、双蒸水、缓冲溶液冲洗毛细管20psi×3 min；每变换1次电泳缓冲液，均用缓冲液平衡至电流平稳(10 min)后才能进样测量。样品及缓冲液均在4℃储存，在使用前用0.45 μm微孔滤膜滤过，且临用前超声脱气处理。
       2.2  多糖的水解精确称取大蒜多糖20.0 mg，置于10 ml具塞试管内，加入2 mol·L-1的 H2SO4 溶液2.0 ml，于100℃水浴中水解8 h，得水解样品溶液。用4 mol·L-1氢氧化钠水溶液中和至pH 7.0，并以纯化水稀释到5.0 ml，离心，吸取上清液，得多糖水解样品。
       2.3  衍生物的制备
       2.3.1  标准单糖混合液的配制分别精密称取甘露糖（Man）0.001 8 g 及半乳糖（Gal）0.003 6 g,鼠李糖（Rha）0.003 6 g，葡萄糖（Glc）0.003 9 g，葡萄糖醛酸（GlcUA）0.003 9 g，半乳糖醛酸（GalUA）0.004 2 g，阿拉伯糖（Arab）0.003 0 g，置10 ml量瓶中，加水溶解并定容至刻度，摇匀，即得。
       2.3.2  标准单糖混合液的衍生精密吸取单糖混合液50 μl，于具塞试管中，分别加入0.3 mol·L-1 NaOH 50 μl和0.5 mol·L-1 PMP甲醇溶液50 μl，涡旋混合30 s，置于70℃水浴反应30 min，冷却至室温，加入0.3 mol·L-1 HCl 50 μl进行中和，加入去离子水100 μl稀释混匀，然后加入1 ml氯仿涡漩混匀30 s，静置5 min，上层水相再重复萃取2次，经0.45 μm微孔滤膜滤过，进样分析。
       2.3.3  多糖水解样品的衍生将水解后的大蒜多糖按“2.3.2”项下方法进行衍生化处理，进样时间20 s。结果见图1～2。
       2.4   线性关系考察取适量标准品混合液按“2.3.2”项方法进行衍生， 经0.45 μm微孔滤膜滤过，用过滤过的去离子水1∶1稀释，分别进样5.0，10.0，15.0，20.0，25.0 s，记录色谱图，进行线性回归。结果见表1。表1  7种单糖的标准曲线（略）
       2.5  进样精密度考察考察所建立方法在相同操作条件下短时间内的精密度：衍生化后，在上述色谱条件下，连续5次重复进样分析。葡萄糖、半乳糖醛酸、鼠李糖、甘露糖、阿拉伯糖、葡萄糖醛酸、半乳糖的峰面积的进样精密度(RSD，n=5)分别为2.7%，2.9%，2.8 %，2.6%，1.9%，2.3%，2.6%。
       2.6  加样回收率取已知含量的多糖水解样品，定量加入单糖混合对照品，以“2.3.2”进行衍生化，重复测定6次，测得吸收峰面积，计算回收率。结果见表2。表2  回收率测定结果（略）
       2.7  多糖样品分析精确称取大蒜多糖依“2.2”“2.3.2”项下方法进行操作，将混合单糖标准品图谱与大蒜多糖的图谱对照，采用校正因子计算单糖组成比例，样品可不加内标进行衍生化HPCE分析。根据分析和计算方法，求得大蒜多糖中葡萄糖、半乳糖醛酸、鼠李糖、甘露糖、阿拉伯糖、葡萄糖醛酸、半乳糖物质的量之比为：18.4∶6.99∶4.21∶4.38∶3.15∶7.21∶4.99。
       3  讨论
       3.1  衍生化除了糖醛酸外，其他中性糖的电离能力非常弱，它们的PMP衍生物电离能力也非常弱，但单糖属于多羟基化合物，能和硼酸根形成带负电荷的络离子，可以选用硼砂液为电泳缓冲液［3］。由图1～2可知，PMP产生的峰可与各单糖衍生物很好地分离，不影响样品的测定。
       3.2  电泳条件优化结果（电泳缓冲液对分离的影响）实验结果表明，缓冲液的酸度和浓度对分离具有明显的影响。7种单糖对照品PMP衍生物的分离度随硼砂缓冲液pH值增加而提高，同时，增加缓冲液中硼砂浓度，分离度提高，但单糖的出峰时间亦有所延长，且电流增加较明显，影响重现性，在本实验条件下，硼砂浓度为75 mmol·L-1时分离效果最为理想，7种单糖衍生物间的分离度R＞1.5。
        通过单糖对照品PMP衍生物CZE分离条件的优化，本实验选择硼砂缓冲液浓度75 mmol·L-1，pH=10.5，电压15 kV，柱温25℃的CZE分离体系，能得到较理想的分离效果。
       【参考文献】
         　　［1］臧至清, 周瑞美.大蒜药用和保健价值的综合开发［J］.食品研究与开发, 1999, 20(2): 25.
       
       ［2］郑 敏, 梅贤臣, 鲍翠玉,等.大蒜多糖体外抗柯萨奇病毒b_3作用［J］.中国现代应用药学, 2005, 22(1): 4.
       
       ［3］honda s, akaoe, suzuki s, et al. high-performance liquid chroma-tography of reducing carbohydrates as strongly ultraviolet-absorbingand electrochemically sensitive1-phenyl-3-methyl-5-pyrazolonederivatives［J］.ana.lbiochem,1989,180:351.
       
       ［4］季宇彬, 郭守东,汲晨锋,等.野西瓜成熟果实中多糖的含量及毛细管电泳分析［J］.中国药学杂志,2006,41(15):1186.
       
       ［5］耿 越, 王建波, 刘靓雯, 等.高效毛细管电泳法测定玉米花粉多糖中单糖的组成［J］.中草药, 2005,36 (8):1164.