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       【摘要】 
       目的建立高效液相色谱法测定大叶蛇葡萄中蛇葡萄素含量的方法。方法色谱条件：Angilent TC-C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流动相为乙腈-0.1%磷酸溶液（15∶85，V/V），检测波长为290 nm。结果蛇葡萄素的回归方程为Y=24 061X+40.07（r=0.999 9，n=6），线性范围为0.101～1.101 μg；平均回收率为99.65%，RSD为1.49%。结论该方法简单、结果可靠，为大叶蛇葡萄药材的质量控制提供了快速准确的测定方法。
       【关键词】  高效液相色谱法； 大叶蛇葡萄； 蛇葡萄素
       Content Determination of Ampelopsin in Ampelopsis megalophylla by HPLC
       CHEN Xiajing,  YAO Hanling,ZHANG Qiuqiong, ZHANG Xiuqiao,LIU Yanwen
       1.Hubei Key Laboratory of Resource Science and Chemistry in Chinese Medicine,Wuhan 430061,China；2.Wuhan Hankou Hospital, Wuhan 430012,China
       Abstract：ObjectiveTo develop a method for determination of the content of Ampelopsin in A- mpelopsis megalophylla Diels et. Gilg by HPLC. Methods The separation was carried out on An- gilent TC-C18(4.6 mm×250 mm,5 μm）with Acetonitrile-0.1%phosphoric acid solution(15:85) as mobile phase，and the detection wavelength was 290 nm. ResultsThe regression equation and coefficient was Y=24 061X+40.07(r=0.999 9，n=6) for Ampelopsin.The linear range was within the range of 0.101～1.101 μg.The average recovery and precision(RSD)of Ampelopsin were 99.65% and 1.49%, respectively. ConclusionThis met hod is simple,accurate and can be used for the quality control of Ampelopsin in Ampelopsis megalo- phylla Diels et. Gilg.
       Key words： HPLC;  Ampelopsis megalophylla;  Ampelopsin
       
       大叶蛇葡萄 Ampelopsis megalophylla Diels et. Gilg 是葡萄科蛇葡萄属的一种植物，是湖北恩施地区民间习用中草药，其性平，味酸、涩，具有清热利湿、活血化淤之功效，用于治疗痢疾、泄泻、小便淋痛、头昏目胀、高血压等病［1］。现代药理学研究表明，大叶蛇葡萄中的主要化学成分蛇葡萄素具有多种药理活性，如保肝护肝、抗肿瘤和降压等［2～4］。本实验室已对大叶蛇葡萄有效部位进行了指纹图谱研究［5］。为了更好地控制其质量，本文用高效液相色谱（HPLC）法对不同来源的大叶蛇葡萄中的蛇葡萄素进行了含量测定。
       1  仪器与材料
          
       Agilent-1100系列高效液相色谱仪(四元泵)；紫外检测器及配套色谱工作站；KQ-250B型超声超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；AL204型万分之一电子分析天平（Mettler- Toledo Group）。对照品蛇葡萄素自制，从大叶蛇葡萄中提取分离得到，经UV、MS、H-NMR、IR光谱分析鉴定结构，并经HPLC面积归一化法检测，含量98.0％ ；大叶蛇葡萄(2009-02采自湖北恩施地区，并由本院生药教研室鉴定)。乙腈为色谱纯；水为双蒸水，其余试剂均为分析纯。
       2  方法与结果
       2.1  色谱条件色谱柱：Angilent TC-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）。流动相：乙腈-0.1%磷酸溶液（15∶85，V/V）；流速：1 ml/mim；柱温：30℃；检测波长：290 nm；进样量：10 μl。
       2.2   对照品溶液的制备精密称取干燥至恒重的蛇葡萄素对照品适量，加甲醇制成每毫升含蛇葡萄素0.101 mg的溶液，作为对照品溶液。
       2.3  供试品溶液的制备精密称取样品（过60目筛）约0.1 g置锥形瓶中，甲醇25 ml，浸泡30 min,超声提取30 min，甲醇定容至30 ml，摇匀，过滤，精密吸取续滤液1 ml于25 ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得供试品溶液。
       2.4  系统适用性实验取对照品溶液、供试品溶液于上述色谱条件下进样，得HPLC图（见图1）。结果在该色谱条件下，供试品在对照品色谱保留时间相应处有相应色谱峰，且样品可得到较好的分离，理论塔板数按蛇葡萄素峰计算大于3 000。
       2.5  线性范围的考察精密量取对照品溶液1，2，4，6，8，10 ml于10 ml量瓶中，加甲醇至刻度，配置成浓度分别为0.010 1，0.020 2，0.040 4，0.060 6，0.080 8，0.101 mg/ml的对照品溶液，按上述色谱条件依次注入高效液相色谱仪，以峰面积（Y）为纵坐标，以标准品的浓度（X）为横坐标，得蛇葡萄素回归方程：Y=24 061X+40.07（r=0.999 9，n=6）。结果表明，蛇葡萄素对照品在0.101～1.101 μg范围呈良好的线性关系。
       2.6  精密度实验精密吸取蛇葡萄素对照品溶液10 μl，连续进样6次，测定峰面积值，计算RSD为0.66%。结果表明，仪器精密度良好。
       2.7  稳定性实验取供试品溶液10 μl分别于0，2，6，8，12，24 h间隔进行测定，测得结果基本一致，峰面积的RSD为1.20％。结果表明，供试品溶液在24 h内稳定。
       2.8  重复性实验取同一批样品按供试品溶液的制备方法平行制备6份，按上述色谱条件进行测定，测定各自含量，其RSD为1.50%。结果表明，该方法重复性良好。
       2.9  加样回收实验精密称取已知含量的6份样品各50 mg，分别精密加入蛇葡萄素对照品适量，按供试品制备和含量测定项下方法操作，结果平均回收率为99.65%，RSD为1.49%。
       2.10  样品含量测定精密称取各样品0.1 g，按“2．3”项下方法操作，按上述色谱条件进样10 μl测定蛇葡萄素峰面积，以外标两点法计算含量。结果见表1。表1  不同来源大叶蛇葡萄中蛇葡萄素含量测定结果（略）
       3  讨论
           
       本文在样品制备方面比较了回流提取法、索氏提取法和超声提取法，发现超声提取法提取完全、操作简便，同时比较了浸泡时间和超声提取时间发现皆以30 min为宜。
        
       现代研究表明蛇葡萄素有很多种药理活性［2］，本次的测定结果表明，其在大叶蛇葡萄中的含量为30%左右，因此，该药物具有广阔的开发利用前景。
       【参考文献】
         　　［1］湖北省卫生局.湖北中草药志(第2册)［M］.武汉:湖北人民出版社，1982:1078.
       
       ［2］董倩倩，陈立峰.二氢杨梅素药理研究进展［J］.中南药学，2005，3（5）：295.
       
       ［3］孙晓杰，沈 伟，张秀桥，等.大叶蛇葡萄抗高血压有效部位筛选实验研究［J］.齐鲁药事，2008，27（12）：747.
       
       ［4］张琼光，丁英平，陈科力，等.蛇葡萄属植物药理学研究概况［J］.时珍国医国药，2005，16（2）：151.
       
       ［5］沈 伟，张秀桥，陈树和，等.大叶蛇葡萄有效部位高效液相色谱指纹图谱研究［J］.时珍国医国药，2007，18（12）：2933.