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       【摘要】 
       目的探讨肾脏水通道蛋白-2(AQP-2)的表达与糖尿病肾病大鼠水液代谢异常及丹参防治作用的机制。方法60只健康SD大鼠分为正常组(10只)，剩余50只采用高糖高脂饲料刺激加小剂量STZ诱导糖尿病大鼠模型成功30只，随机分为模型组、对照组、观察组每组各10只；免疫组织化学检测AQP-2在各组大鼠肾脏中的分布及蛋白质的表达；RT-PCR方法检测各组大鼠AQP-2 mRNA的表达，并以β-actin相对定量。结果肾脏免疫组化显示，AQP-2主要在肾脏的集合管表达。在4组动物的肾脏AQP-2蛋白质［相对阳性面积：正常组(0.119±0.035)，模型组(0.188±0.027)，对照组(0.158±0.036)，观察组(0.154±0.033)］和mRNA［正常组(0．51±0．004)，模型组(0.81±0.059)，对照组（0.78±0.090），观察组（0.70±0.027）］的表达上观察组较模型组均下调（P＜0.01）。结论在糖尿病模型大鼠肾脏组织中AQP-2表达增多，AQP-2的增多可能参与了糖尿病多尿的形成。丹参对水通道蛋白的表达有下调作用，这可能是其利水作用的机制，也是其防治糖尿病肾病的基础。
       【关键词】  糖尿病肾病； 水通道蛋白； 丹参； 链脲佐菌素
        糖尿病肾病（diabetic nephropathy,DN）是糖尿病（diabetes mellitus,DM）最常见的微血管并发症，是糖尿病患者主要的死亡原因之一。DN的基本病变是细胞外基质(Extracellular matrix，ECM)在肾小球、肾小管积聚导致肾小球基底膜增厚和系膜基质增多，出现结节型与弥漫型肾小球硬化。本研究观察丹参对STZ实验性糖尿病大鼠AQP-2蛋白水平和基因水平的表达、尿白蛋白排泄率的改变，旨在探讨AQP-2的表达改变与糖尿病肾病水液代谢异常的关系以及丹参的调节效应，为DN的预防、治疗提供实验依据。
       1  材料
        实验动物选用4周龄雄性SPF级SD大鼠［第四军医大学实验动物中心提供，合格证号：SCXK(军)2002-005)］60只，体质量为(165±12.5)g。SPF级饲养环境，环境温度为2O～25℃，12/12 h昼夜规律，按每笼5只喂养。
       2  方法
       2.1  动物分组及糖尿病模型的建立随机将大鼠分为2组：正常组10只；糖尿病造模组(DM)50只； 正常组进食普通饲料。糖尿病模型组进食高糖高脂饲料，即普通饲料中加入10％的猪油、10％的葡萄糖、1％的胆固醇、2％的蛋黄粉、0.2％的胆酸钠。糖尿病造模组大鼠在高糖高脂饲料喂养4周后尾静脉注射低剂量STZ(30 mg／kg，Sigma公司)1次。该模型具有中度高血糖、高血脂、胰岛素抵抗以及典型的糖尿病肾病改变等特点［1］。以注射后1个月血糖值持续高于7.8 mmol／L，尿糖、尿蛋白阳性者为模型建立成功，共选出成模动物30只，随机分到模型组，对照组和观察组3个组中，每组10只（成模率为60％）。
       2.2  动物的给药及饲养灌胃剂量按大鼠用药剂量为人的10倍计算。对照组：每日灌服格列吡嗪5 mg／kg；观察组：每日灌服丹参5.5 g／kg。正常组和模型组灌服等体积的蒸馏水。实验期间，正常组动物自由饮水，标准饮食，模型组、治疗组、观察组动物给予高糖高脂饮食，自由饮水。
       2.3  肾脏组织的留取实验第16周末时，用25%乌拉坦麻醉大鼠，打开腹腔,从腹主动脉取血,充分暴露手术视野在腹腔的两侧找到肾脏，将部分标本迅速放入4％多聚甲醛中固定，用于石蜡切片。余下部分用消毒铝箔包好迅速放入液氮中，保存于-80℃冰箱中，备用于总RNA的提取。
       2.4  肾脏组织学分析肾组织HE染色。镜下观察肾脏组织的一般形态结构，肾小球、肾小管、间质有无组织学异常。
       2.5  免疫组织化学肾组织免疫组织化学染色(试剂盒均购自武汉博士德生物工程有限公司)。按照免疫组化试剂盒操作步骤进行加样,以SABC法进行检测。先滴加1∶50稀释的AQP-2一抗，4℃ 过夜。滴加试剂2 (羊抗鼠IgG)，室温放置30 min。再滴加试剂3 (SABC)，室温放置30 min。最后DAB显色。细胞浆中呈现棕黄色颗粒为阳性反应，图像采用Miaspro图像分析系统分析。所有切片放大倍数为1000×。每组取6只动物，每只动物AQP-2染色各取2张切片，观察3个视野。视场面积为480 000 mm2，测定阳性面积比［Aa(%)］(阳性面积／视野面积)。表1  AQP－2的表达［Aa(%)］(阳性面积比)和24 h尿蛋白排泄率(略)
       2.6  逆转录一聚合酶链式反应(RT-PCR)①总RNA提取: 采用TaKaRa公司生产的一步法提取总RNA试剂盒，按照试剂盒说明书取200 mg肾脏组织进行操作提取总RNA，用紫外分光光度法测定RNA浓度，RNA浓度=（OD260nm-OD280nm）×稀释倍数×0.04 μg/μl，并用OD260/OD280计算RNA污染程度R，R在1.8～2.0之间;②RNA浓度计算：RNA浓度=A260值×40 μg／ml×50；③RT(逆转录)：AQP-2引物(由宝生物工程大连有限公司合成)，上游：5 "-GCT CCT TTT CGT CTT CTT TGG-3" ，下游：5-GGT CGA GGG GAA CAG CAG GTA-3"。β-actin引物合成：上游：5-CCT TCC TGG GTA TGG AAT CCT-3" ，下游：5-GGA GCA ATG ATC TTG ATC TT-3" ;④逆转录反应：按照试剂盒说明书进行cDNA逆转录反应，逆转录反应加入试剂含25 mmol/L  MgCl2  2 μl、10×RT Buffer 1 μl、RNase Free dH2O 3.75 μl、dNTP  Mixture（各10 mmol/L） 1 μl、RNase Inhibitor（40 U/μl） 0.25 μl、AMV Reverse Transcriptase（5 U /μl） 0.5 μl、特异性下游引物 20 pmol 0.5 μl、提取总RNA样本1.0 μl作为模板，总体积10 μl，反应条件为42℃ 30 min、95℃ 5 min、5℃ 5 min一个循环，-20℃保存备用；⑤扩增半定量多聚酶链反应： 反应条件95℃ 预变性3 min，94℃  45 s、60℃  40 s、72℃  45 s  30个循环，最后一个循环72℃延伸3 min。扩增结束后20 g/L琼脂糖凝胶检测，在紫外灯下观察结果并拍照保存，BIO-RAD凝胶成像分析系统(BIO-RAD公用)采集图像并进行分析。PCR检测结果以经β-actin校正后的A值表示。Mark为TaKaRa公司的DNA Mark DL2000。
       2.7  统计学处理实验数据以±s表示。SPSS 10.0统计软件进行分析，采用One-way ANOVA法进行方差分析。两两比较时根据其方差是否齐性选择LSD（方差齐性）或Dunnett C（方差不齐）方法。P<0.05表示有统计学意义。
       3  结果
       3.1  24 h尿蛋白排泄率状况模型组大鼠24 h尿蛋白排泄率最高。动物的24 h尿蛋白排泄率较模型组明显降低，模型组、对照组和观察组24 h尿蛋白排泄率均高于正常组。
       3.2  大鼠肾脏的病理改变肾脏的HE染色可见对照组大鼠为正常的肾脏组织结构，模型组肾脏损害为片状分布，以髓袢偏髓质的近曲小管为主的上皮细胞空泡状变性、肿胀，肾小球内可见红细胞淤积，病变严重的部位肾小管上皮细胞脱落。对照组上皮细胞空泡状变性较模型组轻，但肾小球内红细胞淤积未见改善，观察组上皮细胞空泡状变性较模型组轻，肾小球内少见红细胞淤积的情况，肾小管未见上皮细胞脱落。
       3.3  AQP-2在肾脏的蛋白质表达对大鼠肾脏的免疫组织化学染色结果提示,AQP-2蛋白在肾脏的集合管表达,而在肾小球和肾间质未见表达,与已往报道一致［2］。模型组大鼠肾脏AQP-2蛋白的免疫组化染色结果显示,沿集合管内壁上皮细胞分布的棕黄色颗粒比对照组明显颜色加深而浓厚,分布面积更广泛。上述结果说明模型组大鼠肾脏AQP-2在蛋白质水平上表达增强。对照组和观察组AQP-2的棕黄色程度比模型组要浅的多（P< 0.05），结果见图1及表1。
       3.4  大鼠肾脏AQP-2 mRNA的表达RT－PCR产物电泳结果显示,模型组大鼠肾脏髓质AQP－2 mRNA的表达明显高于正常组,分别为（0.81±0.059）和（0.51±0．004）(P< 0.01)。观察组（0.70±0.027）明显低于模型组( P< 0. 05)，为该结果与肾脏AQP-2免疫组织化学的结果相一致。结果见图2。
       4  讨论
          
       AQP已被证实是一组对水有高度选择性的细胞膜转运蛋白，是跨膜水运的重要通道 ，这为研究糖尿病肾病水代谢的异常提供了新的角度。目前研究表明，尿液浓缩稀释功能由肾脏集合管主细胞的AQP-2来完成，而AQP-2的表达主要受加压素(anti－diuretichormone vasopressin，AVP)的调节。AVP与肾脏集合管主细胞基底膜上的AVP V2受体结合后，使细胞内cAMP浓度升高，激活PKA，将AQP-2蛋白磷酸化，使之从囊泡穿梭到管腔膜，从而提高集合管对水的通透性［3］，同时该信号通路激活CREB元件，刺激AQP-2的合成，表现为AQP-2 mRNA和蛋白水平的提高，从而实现AVP的抗利尿作用。既往研究表明在DM大鼠中血AVP水平升高［4］，这可能与水钠潴留有关。从理论上讲,DM大鼠血浆渗透压升高,刺激VP分泌增加,促进肾小管对水的重吸收,以降低血浆渗透压,同时提高尿渗透浓度,尿量减少。而实际上对于DM大鼠来说,这种负反馈机制在早期处于代偿状态,VP代偿性升高,在晚期则处于失代偿状态,尽管有回吸收水分的倾向,但尿量仍然增加。VP对AQP－2的调节包括短期调节和长期调节,本研究中DM大鼠AQP－2的mRNA表达增加,促使AQP－2合成增加,导致水通透性增加,尿量增加,应属于长期调节。
       
       祖国医学所认识的消渴病日久出现的“水肿”“胀满”“尿浊”“关格”与现代医学的糖尿病肾病的临床症状相似。丹参之脂溶性成分包括丹参酮、水溶性成分丹参素、原儿茶醛、丹参酚酸B，研究证实丹参增加肾血流、有利尿和抗炎作用，可降低血BuN、Scr，调节肾组织局部微循环，改善肾功能。临床观察证实，丹参在改善早期DN患者的水肿、血液流变学等症状、降低FPG、BuN、UAER、Scr上都有很好的疗效［5，6］。孙兴旺等［7］研究发现，丹参酮可抑制肾成纤维细胞增殖，降低细胞内胶原合成率。
       
       本研究结果表明丹参能显著降低糖尿病肾病大鼠24 h尿蛋白排泄率。病理提示对照组、观察组较模型组损伤明显减轻，说明单纯用降糖药物对改善DN的血流动力学效果不佳,而丹参可全面调理DN状态时的血液流变学情况,延缓肾小球硬化的发生,从而对糖尿病肾病起到保护的作用。同时我们又发现用丹参治疗能显著降低糖尿病大鼠肾组织中的AQP-2蛋白表达和基因表达，因此我们推测丹参对糖尿病大鼠肾脏的保护作用可能与降低AQP-2的表达有关。但是糖尿病时丹参与AQP－2在高血糖时的相互作用的确切表达机制有待进一步深入研究。
       【参考文献】
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       ［3］Nielsen S,Kwon TH,Frokiaer J,et al．Key roles of renal aquaporins in wate balance and water balance disorders［J］.Nexevs Physiol Sci,2000.15:136.
       
       ［4］杜娟,张素华.糖尿病大鼠肾脏髓质水通道蛋白2的表达和意义［J］.中华内分泌代谢杂志,2006,22(1):67.
       
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       ［6］李锋,王汉民,行 利，等.泽黄颗粒治疗糖尿病肾病38例临床观察［J］.中国中医药信息杂志,2005,12（10）:64.
       
       ［7］孙兴旺,曹 灵,于国华，等.丹参酮Ⅱ-A磺酸钠对纤维化人肾间质成纤维细胞体外增殖及cyclin E蛋白表达的影响［J］.第二军医大学学报,2007，29（7）:585.