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       【摘要】 
       目的通过建立脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）诱导痛觉增敏模型，以对乙酰氨基酚作为阳性药物，观察粉防己碱（Tetrandrine，Tet）对LPS致痛觉增敏小鼠的镇痛效应，进一步研究Tet镇痛与IL-6和TNF-α的关系。方法随机将小鼠分为空白组、模型组、对乙酰氨基酚组、Tet 5,15,45 mg／kg 6组，通过腹腔注射LPS 100 μg／kg建立痛阈增敏疼痛模型，采用醋酸扭体法和热板法观察Tet的镇痛效应；ELISA法检测血浆中IL-6、TNF-α的含量变化。结果 Tet 5，15，45 mg/kg各组明显减少醋酸扭体次数，提高小鼠痛阈。减少血浆TNF-α含量、抑制IL-6的产生。结论Tet具有镇痛活性，其作用机制可能是Tet 抑制内毒素诱导小鼠血液中IL-6的产生、减少血浆TNF-α的含量。
       【关键词】  粉防己碱； 脂多糖； 镇痛； 白介素-6； α-肿瘤坏死因子
       Studies on Analgesic Effect and Mechanism of Tetrandrine on Lipopolysaccharide-induced Hyperalgsia in Mice
       DAI Xiankun, LUO Fuling, ZHANG Zhuo, LI Hongzhong, ZHANG Li, WAN Jingyuan
       Department of Pharmacology, Chongqing Medical University, Chongqing 400016, China
       Abstract:ObjectiveTo investigate the effects of tetrandrine on LPS-induced hyperalgsia in Kunming mice and its possible mechanisms.MethodsMice were divided randomly into normal group , model group, acetaminophen group and Tet 5,15 ,45 mg·kg-1 groups, hyperalgsia was induced by intraperitoneal administration of LPS 100 μg kg·kg-1 in mice.The analgesic effect of Tet was assessed by the hot-plate stimulation and the writhing test induced by acetic acid,the contents of IL-6 and TNF-α in plasma were test by ELISA.Results Tetrandrine doses of 5，15 ,45 mg·kg-1 significantly reduced the number of writhing response, increased pain threshold and decreased the contents of IL-6 and TNF-α. ConclusionTetrandrine has analgesic effect and its effect may be related to decreasing the contents of IL-6 and TNF-α.
       Key words:Tetrandrine;  Lipopolysaccharide;  Analgesia;  Interleukin- 6;  Tumour necrosis factor-α
        疼痛是炎症的四大症状之一。内毒素可诱导大量与疼痛相关的炎性细胞因子释放，包括IL-6、TNF-α、PGE2等。这些炎性细胞因子作用于伤害感受器，引起机体疼痛反应。Tet是传统抗风湿中药粉防己根中有效生物碱，具有抗风湿作用，对于其镇痛效应有文献提及，但未见具体文献报道。本实验以脂多糖诱导疼痛增敏为模型探讨粉防己碱是否能调节相关炎症因子而有镇痛效应，并进一步研究镇痛的分子机制。
       1  材料与仪器
       1.1  动物 昆明种清洁级小鼠体质量18～22 g，10周龄，重庆医科大学动物中心提供，合格证号：SYXK(渝)2002007。
       1.2   试剂和仪器粉防己碱(纯度大于98％，分子式：C38H42O6N2，分子量：622.76 ),浙江金华制药厂），对乙酰氨基酚（中国上海集团化学试剂有限公司，批号：20050578），脂多糖LPS(Escherichcacoli endotoxin055：B5，sigma，L2880)，IL-6、TNF-α ELISA试剂盒（Cayman公司），醋酸（重庆川东化工集团有限公司）。
       2  方法
       2.1  对小鼠冰醋酸扭体法的影响 取昆明种小鼠60只，雌雄各半，体质量18～22 g，随机分为空白组，模型组，对乙酰氨基酚组（50 mg ／kg），粉防己碱5，15，45 mg/kg组，共6组，每组10只。粉防己碱溶解于三蒸水中，分别配成0.5，1.5，4.5 g／L，适应性饲养3 d，分别给予对应药物ip预处理30 min，空白组和模型组给予等量蒸馏水，30 min后除空白组外各组给予LPS 100 μg·kg-1 ip，6 h后各组小鼠再腹腔注射体积分数0.7％醋酸溶液0.2 ml。观察20 min内出现的小鼠扭体反应次数，进行组间比较。
       2.2  对小鼠热板法的影响 取昆明种雌性小鼠，体质量18～22 g,将热板温度控制于（55±0.5）℃，把小鼠置于热板上，开始记时，观察小鼠对热刺激的反应。以舔足动作为疼痛指标，在5～30 s内出现舔后足动作者，取出留作实验用，否则认为其疼痛过敏或耐受，弃置不用。所经历的时间作为痛阈值，连续测量3次，间隔5 min，取其均值为基础痛阈值。筛选合格的60只小鼠。随机分组、给药剂量、给药方式、造模方式同“2.1”项。造模后每小时测 痛阈值，连续监测6 h，每次测量2次，间隔10 min ，取其均值。随后（造模6 h后）眼球取血约1 ml，3 000×g,10 min离心，取血浆-80℃保存，第2天用ELISA法测IL-6 和 TNF-α。
       2.3  ELISA法检测血浆IL-6、TNF-α的含量按照试剂盒操作，酶标仪450 nm检测IL-6、TNF-α的含量（pg·ml-1）。
       2.4   统计学处理采用SPSS软件进行数据处理，数据以±s表示。组内比较采用单因素方差分析，组间比较采用t检验，P<0.05为显著差异， P<0.01为差异非常显著。
       3  结果
       3.1  Tet对小鼠醋酸扭体次数的影响
       同空白组比较，模型组扭体次数明显增加，有显著差异（P<0.01），提示造模成功。对乙酰氨基酚组扭体次数明显减少。同空白组和模型组比较，Tet各组不同程度减少小鼠扭体次数，其中15，45 mg·kg-1组抑制效应有显著差异（P<0.01），但仍然弱于对乙酰氨基酚组，小剂量组效果不明显。结果见表1。
       3.2  Tet对小鼠热板刺激痛阈值的影响
       同空白组比较，模型组动物舔后足潜伏期缩短，表现出疼痛过敏现象。对乙酰氨基酚组延长舔足时间。粉防己碱与对乙酰氨基酚作用相似，具有良好的镇痛效应，其中45 mg·kg-1剂量组效果明显，与空白组和模型组比较有显著差异（ P<0.01）。见表2。
       3.3  Tet对小鼠血浆TNF-α、IL-6的影响
       同空白组比较，模型组血浆IL-6、TNF-α明显增加；同模型组比较Tet各剂量组均减少小鼠血浆TNF-α含量（P<0.01），抑制 IL-6产生，其中15，45 mg·kg-1剂量组效果明显，有显著差异（P<0.01）。结果见图1。表1  粉防己碱对小鼠醋酸扭体次数的影响（略）
       4  讨论
           
       粉防己碱始载于《神农本草经》，列为上品，中医认为其具有祛风止痛、利水消肿的作用。粉防己碱属生物碱化合物，是粉防己中主要有效成分。现代药理学研究表明，Tet具有抗炎［1］、镇痛、降压［2］、抗矽肺［3］、抗类风湿关节炎［4］、抗肿瘤［5］等作用。据文献［6］报道，粉防己碱对LPS致内毒素血症和脓毒症有显著作用，提示粉防己碱对LPS诱导的炎症有显著作用。目前国内外对粉防己碱的药理作用研究有大量的文献报道，其解热、镇痛方面的报道不多，特别是对于粉防己碱在LPS诱发的全身炎症反应动物的镇痛作用未见报道，因此本文以乙酰氨基酚有效抑制动物疼痛反应为对照，利用经典的LPS 诱导建立小鼠痛觉增敏模型观察粉防己碱对痛觉增敏有无镇痛作用，选择检测血浆中TNF-α、IL-6的含量初步探讨其镇痛机制。表2  粉防己碱对小鼠热板刺激痛阈值的影响（略）
        
       脂多糖作为细菌内毒素是革兰氏阴性菌细胞壁的主要成分，是一个强的炎症反应诱导分子，脂多糖通过激活单核和巨噬细胞产生一系列致炎介质如TNF-α、IL-1和COX-2等，可以诱导机体产生发热、休克及痛觉增敏等表现，研究发现腹腔注射 LPS能够诱导痛觉增敏，增加肌肤对机体不同刺激疼痛的敏感性，这种痛觉增敏与LPS刺激机体释放促炎症介质有关，而且迷走神经的传导可能参与这种疼痛增敏效应［7,8］。本实验经预试后选择100 μg/kg LPS腹腔注射，建立疼痛增敏模型，模型组动物呈现出明显痛觉过敏现象，表现为热板法舔足潜伏期缩短和扭体反应次数明显增加，提示本实验造模成功。但是在热板实验中，第1小时与空白组比较无显著差异，这可能与小鼠个体差异有关。结果显示Tet呈剂量依赖性的镇痛效应，45 mg·kg-1组效果最为明显。
        
       细胞因子在外周炎症性疼痛和神经源性疼痛的产生和维持中起重要作用，其中IL-6、TNF-α与痛觉感受密切相关的细胞因子，参与LPS诱导的炎症性痛觉过敏［9］。LPS可以诱导COX、TNF-α表达，TNF-α促进 IL-6产生，而 IL-6可以与相应受体结合作用于COX而引起PGs产生增加，由此触发炎症瀑布反应。由于LPS诱导的痛觉增敏与炎症有关系，因此本实验除检测TNF-α、IL-6的含量，从而判断药物是否通过抗炎效应而抑制痛觉增敏，达到镇痛效应。结果显示Tet减少血浆中IL-6、 TNF-α的含量，并且呈剂量依赖性。
        
       终上所述，本实验证明了粉防己碱呈剂量依赖性的抑制LPS所致痛觉增敏，其镇痛效应与抑制IL-6、 TNF-α的表达有关，其镇痛效应还有没有通过其他途径参与尚值得进一步研究。
       【参考文献】
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