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       【摘要】 
       目的建立以高效液相色谱法测定附子中新乌头碱含量的方法。方法采用Welchrom-C18 色谱柱(5 μm ,4.6 mm×250 mm)，以甲醇－水－三乙胺（75∶25∶0.033）为流动相，流速为1.0 ml·min-1，检测波长为233 nm，柱温为30℃。结果新乌头碱在0.046 4～0.324 8 μg范围内呈良好线性关系，r=0.999 9；平均回收率为100.7%，RSD=2.19%。结论该方法操作简便、准确、重复性好，可用于附子中新乌头碱的含量测定。
       【关键词】  附子； 新乌头碱； 高效液相色谱法
        附子为毛茛科植物乌头Aconitum carmichaeli Debx.子根的加工品，具有回阳救逆、补火助阳、逐风寒湿邪的功效［1］。附子的主要成分是乌头类生物碱，可分为单酯类、双酯类和胺基醇类生物碱。其中以双酯型类生物碱如乌头碱、次乌头碱、新乌头碱成分毒性较大，但又同时是附子的药性成分。历代医家都非常重视附子的毒性及其用量［2］。为保证用药的安全性，本文在参考有关文献的基础上［3，4］，对附子生品中的新乌头碱进行含量测定，希望能够为其在质量控制方面提供一定的依据。
       1  仪器与试药
       1.1  仪器岛津LC-20A高效液相色谱仪,HS10260D超声洗洁器，XS205电子天平（十万分之一），JT1003电子天平（千分之一）。
       1.2  试药新乌头碱对照品（中国药品生物制品检定所，供含量测定用，批号： 110799－200404）；甲醇为色谱纯；三乙胺、乙醚为分析纯；盐酸；氨水；纯净水。
       2  方法与结果
       2.1  色谱条件色谱柱： Welchrom-C18 (5 μm ，4.6 mm×250   mm)；流动相为甲醇-水-三乙胺（75∶25∶0.033）；流速：1.0 ml·min-1；检测波长：233 nm；柱温：30℃。进样量：5 μl。在该色谱条件下，新乌头碱与杂峰分离良好。结果见图1～ 2。
       2.2  溶液的配制
       2.2.1  对照品溶液的制备精密称取新乌头碱对照品适量，配制成0.116mg·ml-1的对照品溶液，再精密吸取此对照品溶液，0.4，0.8，1.2，1.6，2.0，2.4，2.8 ml分别定容于5 ml容量瓶中。
       2.2.2  样品溶液的制备精密称取生附子粉末（40目）约1.4 g，置于具塞三角锥形瓶中，加入浓氨水2 ml，浸润0.5 h,再加75 ml乙醚摇匀，放置过夜，超声（功率500 W，工作频率40 kHz）提取15 min,过滤，再以25 ml乙醚分次洗涤药渣，过滤，合并滤液和洗液，45℃水浴挥干，0.037％盐酸甲醇溶液溶解残渣，并定容至25 ml，摇匀，临用前用0.45 μm微孔滤膜滤过，即得供试样品溶液。
       2.3  标准曲线的绘制取“2.2.1”项下制得的对照品溶液，均进样5 μl，在233 nm处检测，以峰面积值（A）对进样量（C）进行线形回归，得回归方程为：A=8 625 582 C -142.311 5，r＝0.999 9（n=7），结果表明,在0.046 4～0.324 8 μg范围内新乌头碱峰面积与进样量呈良好的线性关系。
       2.4  精密度实验精密吸取同一供试样品溶液5 μl注入高效液相色谱仪,重复进样6次，测得新乌头碱的峰面积，RSD=1.52％。结果表明仪器精密度良好。
       2.5  稳定性实验精密吸取放置0，2，4，6，8 h的样品溶液5 μl分别注入高效液相色谱仪，测得相应的峰面积，RSD=2.19％。结果表明，供试品溶液在8h内稳定性良好。
       2.6  重复性实验精密称取同一药材6份按“2.2.2”项下供试品的制备方法制备，分别吸取上述样品溶液5 μl注入高效液相色谱仪，测其峰面积并计算含量，RSD=2.06％。
       2.7  加样回收率实验精密称取已知含量样品（约0.7g）9份，分别精密加入新乌头碱对照品溶液适量使其中新乌头碱含量为样品中新乌头碱含量的80%（3份）、100%（3份）、120%（3份）。按“2.2.2”项制备，按上述色谱条件测定，并计算新乌头碱含量及RSD值。结果见表1。表1  回收率实验结果（略）
       2.8  样品含量测定对生附子、白附片、黑附子3种药材分别按“样品溶液的制备”方法处理，依法测定。结果见表2。表2  样品含量测定结果（略）
       3  讨论
          
       通过对3种不同炮制方法所制成的附子中新乌头碱的含量测定可知，不同炮制方法的附子中新乌头碱的含量差别较大，其中生附子中新乌头碱的含量较高。
       
       本实验中曾进行了流动相系统的优化研究，比较了乙腈－0.03％乙二胺（46∶54），乙腈－0.03％乙二胺（40∶60），乙腈－0.03％乙二胺（42∶58），乙腈－0.2％冰醋酸＜三乙胺调pH6.25＞（37∶63），甲醇－水－三乙胺（70∶30∶0.1），甲醇－水－三乙胺（70∶30∶0.04），甲醇－水－三乙胺（90∶10∶0.04），甲醇－水－三乙胺（80∶20∶0.08），甲醇－水－三乙胺（75∶25∶0.1），甲醇－水－三乙胺（72∶28∶0.037），甲醇－水－三乙胺（74∶26∶0.035），甲醇－水－三乙胺（75∶25∶0.033）等流动相系统的出峰效果，以最后一种对新乌头碱的检测效果最佳，在此色谱条件下，新乌头碱与杂峰分离良好、峰形亦佳，故选用此流动相。
       
       在样品的提取方法上，我们对直接超声提取及放置过夜后超声提取两种提取方法的提取效果进行了对比研究，结果发现放置过夜后超声提取对新乌头碱的提取率最高，且通过加样回收率实验说明放置过夜后超声提取方法对新乌头碱的提取可靠，同时，发现超声提取时间对新乌头碱的含量有显著影响。以超声15 min的提取率最高（再增加提取时间其含量无明显升高，故选15 min）。
        在定容溶剂的考察上，我们分别对二氯甲烷和盐酸－甲醇溶液的效果进行了对比研究，结果发现用盐酸－甲醇溶液定容时供试液的稳定性较好。对于盐酸－甲醇溶液的浓度，查文献资料及试验验证后，采用0.037％。
       
       采用高效液相色谱法测定附子中新乌头碱的含量此方法具有简便、可靠、重现性较好的优点。但由于采用手动进样器，且无在线脱气系统,其结果容易受流动相、空气湿度、温度、操作人等诸多因素影响。因此应注意高效液相色谱的规范化操作,保证实验测定的准确性和稳定性。
       【参考文献】
         　　［1］国家药典委员会.中国药典， I部［S］.北京：化学工业出版社，2005：132.
       
       ［2］江京莉，周远鹏.附子的药理作用和毒性［J］.中成药，1991，13（12）：37.
       
       ［3］王 瑞，刘 芳，孙毅坤，等.不同附子炮制品中乌头碱、新乌头碱、次乌头碱含量的HPLC测定［J］.药物分析杂志，2006，26（10）：1361.
       
       ［4］边宝林，司 南，王宏洁，等.附子单煎以及与浙贝母合煎后乌头碱、次乌头碱、新乌头碱含量等有毒成分的含量变化研究［J］.中国实验方剂学杂志，2006，12（4）：9.