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       【摘要】 
       目的探讨复方丹参滴丸（CDDP）干预骨髓基质细胞（BMSC）移植治疗急性心肌梗塞（AMI）后，是否对心功能及梗塞面积改善有促进作用。方法利用SD大鼠建立AMI模型，体外分离、培养、鉴定同种异体大鼠的BMSC，选用3～4代BMSC，移植于心梗模型大鼠体内，移植后给予不同方法干预。术前、术后4周采用超声心动图检测大鼠心脏结构和功能指标。术后4周，取大鼠心肌组织，氯化硝基四氮唑蓝（NBT）染色，测定心肌梗塞面积。结果①术前各组心脏结构和功能指标比较，差异无显著性(P>0.05)。术后4周，各手术组舒张末期左室后壁厚度（LVPWd）、收缩末期左室后壁厚度（LVPWs）增大；左室舒张末期内径（LVDd）增大、射血分数（EF）降低，与正常组比较差异显著(P<0.05)，其中BMSC移植+G-CSF（粒细胞集落刺激因子）组、BMSC移植+CDDP组增大(EF降低)幅度最小，与模型组比较P<0.05，两组之间比较无显著性差异(P>0.05)。②术后4周，各手术组心室肌组织均有不同程度梗塞，各治疗组均有减小梗塞面积的趋势，与模型组比较有显著性差异（P<0.01）；BMSC移植+CDDP组 、BMSC移植+G-CSF组与BMSC移植组比较梗塞面积减轻程度有显著性差异（P<0.05），两组之间无显著性差异（P>0.05）。结论CDDP可能通过干预大鼠AMI后植入干细胞的成活分化，减小心肌梗塞面积，有益心功能改善。
       【关键词】  复方丹参滴丸； 骨髓基质细胞； 急性心肌梗塞； 梗塞面积； 心功能
        AMI为冠心病严重类型，指冠状动脉急性闭塞，血流中断，所引起的局部心肌的缺血性坏死，临床表现可有持久的胸骨后疼痛、休克、心律失常和心力衰竭，并有血清心肌酶增高以及心电图的改变。目前AMI的治疗有药物和手术干预等措施。包括药物治疗在内的措施，能挽救部分濒死心肌，在一定程度上改善心功能但却无法增加患者存活心肌细胞数量。干细胞移植作为一种新兴的生物学方法，对缩小心肌梗塞的范围，限制梗塞灶的扩大，替代梗塞心肌，阻止梗塞后心肌重构，改善心脏功能，有强大潜力。目前，国内外常用的诱导干细胞分化的药物有5 -氮胞苷、二甲基亚砜等。本实验采用CDDP作为诱导剂，旨在研究中药是否能提高BMSC对心肌梗塞的修复与可能的机制。
       1  材料与仪器
       1.1  动物雄性SD大鼠，体质量80～100 g（细胞培养）、200～250 g（造模），由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，动物许可证号：scxk京2007-0001。
       1.2  材料与仪器复方丹参滴丸（天津天士力集团），重组人粒细胞刺激因子（杭州九源基因工程有限公司），胎牛血清（美国GIBCO公司），DMEM-LG干粉培养基（美国GIBCO公司），氯化硝基四氮唑蓝（美国Sigma公司），流式细胞仪（美国Becton-Dikinson公司），彩色超声心动仪（GEL-400型，9MHz矩阵探头），TKR-200C型小动物呼吸机，多导生理仪（美国Biopac公司），电子天平（Mettler AL204，瑞士）。
       2  方法
       2.1  BMSC的体外分离、培养与纯化80～100 g雄性SD大鼠，引颈脱臼处死。严格无菌条件取出其双侧股骨和胫骨，用DMEM培养基对骨髓腔进行反复冲洗，至骨变白，将收集液以1 000 r/min，20℃，离心8 min,弃上清液，加入全培养基，置入37℃，5%CO2饱和湿度环境中培养。根据BMSC贴壁生长的特性，每隔3～4d换液1次，弃去未贴壁的其它细胞。经过数次换液后，未贴壁细胞和贴壁细胞中自我更新能力差的细胞逐渐除去，从而得到比较纯化的BMSC。待增殖细胞铺满瓶底80%～90%时，用0.125%的胰酶（含0.005%EDTA）进行消化传代，传代后继续培养，直至得到较纯化的BMSC。
       2.2  BMSC的鉴定消化细胞后，取单细胞悬液100 μl，分别加入荧光标记单克隆抗体小鼠抗大鼠FITC-IgG1 CD31，CD45，CD-90，PE-IgG1 CD34，CD106抗体工作液10 μl，阴性对照小鼠IgG1-PE，小鼠IgG1，k-PE小鼠IgG1-FITC，进行流式细胞仪鉴定。
       2.3  实验分组实验大鼠随机分为正常组、模型组、BMSC移植组、CDDP+BMSC移植组、G-CSF+BMSC移植组。CDDP+BMSC移植组，术后灌服丹参滴丸悬浊液28 d，68.52 mg/kg ，1次/d；G-CSF+BMSC移植组皮下注射G-CSF 5 d，2 mL/kg，1次/d。各组均给普食，自由饮水。
       2.4  大鼠急性心肌梗塞模型的建立和BMSC的移植10%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，气管切开插管，连接小动物呼吸机，待呼吸平稳后，于左侧胸部3～4肋间逐层开胸，暴露心脏，挑破心包，用5/0无损缝合线在左冠状动脉前降支中1/2处结扎，观察多导生理仪记录的心电图标准Ⅱ导联，见到ST段弓背抬高，提示已发生AMI，关胸前，用0.5 mm×16 mm无菌注射针将100 μl（5×105）细胞悬液注入缺血区心肌组织。术后常规抗感染治疗，分笼喂养。
       2.5  大鼠心功能的测定动物麻醉，取平卧位，剪去胸前区毛，涂耦合剂。参照文献［1］方法，高频矩阵探头垂直于左胸壁，扫描深度调至4～5 cm，转动探头角度，显示心脏沿二尖瓣口至心尖方向的左室长轴与垂直于左室长轴的左室短轴像。在B超左室长轴像引导下，将扫描深度调至4 mm，于左室内径最大处显示M型超声图像，测量左室内径及室壁厚度。然后将取样容积置于二尖瓣处，显示多普勒超声，测量血流速度。
       
       测量参数：舒张末期左室后壁厚度（LVPWd）、收缩末期左室后壁厚度（LVPWs）、左室舒张末期内径（LVDd）、射血分数（EF）。
       2.6  NBT染色及梗塞面积的测定术后4 周，过量麻醉处死大鼠，胸骨正中剪开取出心脏，可见到大鼠梗塞心脏明显梗塞区，生理盐水冲洗余血，沿冠状沟剪去心房及各大血管，留取心室组织，在电子天平上称心室质量。然后将心室肌切成4～5片，每片厚约0.1 cm，置0.5%的NBT染色液中，常温染色15 min，剪下梗塞区，称取梗塞区心肌质量，计算梗塞区心肌占心室质量的百分率。
       2.7  统计学方法数据用±s表示，采用SPSS11.5软件进行统计，组间对比采用方差分析， P＜0.05为差异有显著性。
       3  结果
       3.1  BMSC流式细胞仪鉴定培养细胞表面抗原CD90表达强阳性，阳性率为99.72%，CD106表达弱阳性，阳性率16.92%，不表达CD45、CD34和CD31。
       3.2  心功能测定结果结果见表1。表1  各组LVPWd，LVPWs，LVDd，EF比较（略）
       3.3  NBT染色及梗塞面积测定大鼠心室肌组织薄片经NBT染色液处理15 min后，可见到正常心室肌组织被染成均匀的蓝色，梗塞区未着色。各实验组梗塞面积情况见表2。表2  梗塞区质量占心室质量百分比（略）
       4  讨论
        BMSC作为成体干细胞，主要存在于骨髓组织中，具有自我更新的特点和跨胚层分化潜能，在特定条件下，可分化为成骨细胞、成软骨细胞、脂肪细胞、肌肉细胞、神经细胞等。Alexandrina Burlacu等 ［2］研究体外培养条件下，BMSC在5-aza诱导下可向心肌细胞分化。有学者［3］将BMSC在梗塞大鼠心肌内注射，发现BMSC移植后cTnT表达阳性，梗塞面积缩小(P<0.001)，并可以使缺血心肌区域的血管发生和心肌形成，从而改善心功能。本实验将体外培养的BMSC不经诱导直接移植到心梗大鼠体内，用CDDP及G-CSF干预BMSC的体内分化。术后4周，各手术组LVPWd、LVPWs增大，LVDd增大，EF降低，表明各手术组均出现不同程度的左室重构及心脏收缩功能的下降。其中中西药干预组LVPWd、LVPWs、LVDd增大幅度最小，EF降低幅度最小，表明CDDP可以延缓心室重构的进程，减轻了心肌的收缩功能的下降，且其作用与G-CSF的作用相当(P>0.05)。组织学测量两组梗塞面积较模型组有明显缩小，且优于单纯细胞移植组，说明CDDP与BMSC结合可发生协同增效作用，与文献报道结论相似［4］。提示CDDP对心肌梗塞BMSC植入后心脏的结构及功能的改善有促进作用。
       
       CDDP具有很好的活血化淤作用，我们推测，其提高BMSC对AMI的修复作用，可能与其增加心肌能量储备，抑制脂质过氧化物的生成而保护心肌［5］的作用有关，亦可能与其通过限制氧自由基生成、细胞溶解和内膜损伤，较好地减轻缺血再灌注损伤，改善缺血所致的心功能不全［6］的作用相关。CDDP可能通过多靶点参与干预BMSC的分化，通过调控心肌微环境促进BMSC分化为心肌细胞，确切的机制还有待于进一步研究。积极开展中药诱导干预BMSC分化并与干细胞移植结合起来，将有益于缺血性心脏病治疗工作的进展。
       【参考文献】
         　　［1］Litwin SE, Katz SE, Morgan Jp,et al.Serial echocardiographic assement of left ventricular geometry and function after large myocardial infarction in rats［J］.Circulation,1994,89:345.
       
       ［2］Alexandrina Burlacu,Ana-Maria Rosca,HoriaManiu, et al. Promo ting effect of 5-azacytidine on the myogenic differentiation of bon marrow stromal cells［J］. European Journal ofCellBiology, 2008, 8(3): 173.
       
       ［3］Liu JF,Wang BW,Hung HF,et al.Human mesenchymal stem cells improve myocardial performance in a splenectomized rat model of chronic myocardial infarction［J］.J Formos Med Assoc,2008,107(2):165.
       
       ［4］李连达，张荣利，刘成源，等.双龙方与自体骨髓单个核细胞经心导管移植对中国小型猪心肌梗塞的影响［J］.中国新药杂志，2003，12(12):999.
       
       ［5］赵雅君，朱世军，史从宁，等.大鼠心肌缺血再灌注时能量代谢及脂质过氧化变化及复方丹参滴丸的保护作用［J］.哈尔滨医科大学学报，2003，37(4):290.
       
       ［6］高秀梅，张伯礼.丹参及提取物对心血管系统药理作用研究进展［J］.天津中医，2002，19(1): 74.