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       【摘要】 
       目的采用鸡胚绒毛尿囊膜（CAM）法观察复方红豆杉胶囊对血管生成的影响。方法种蛋在孵育7d后制备CAM模型，复方红豆杉胶囊低、高剂量含药血清、生理盐水、硫酸鱼精蛋白、空白血清滴加于CAM表面载体上，作用48h后观察胚胎存活情况，显微镜下计数CAM载体周围的一、二级血管数目。结果复方红豆杉胶囊低、高剂量组均有抑制CAM血管生成作用，一、二级血管数目明显少于生理盐水和空白血清组（P<0.01）。结论复方红豆杉胶囊具有明显的抑制CAM血管生成的作用。
       【关键词】  复方红豆杉胶囊； 鸡胚绒毛尿囊膜； 血管生成
        复方红豆杉胶囊是中药复方制剂，由红豆杉、红参、甘草3味中药组成，适用于肺癌、胃癌、大肠癌、肝癌、口腔癌等中晚期癌症的治疗［1～3］，对放化疗有增效作用。复方红豆杉胶囊临床上抗肿瘤作用疗效确切，但是否具有抑制肿瘤血管生成的作用，目前尚未见报道。本研究利用鸡胚绒毛尿囊膜法观察复方红豆杉胶囊对血管生成的影响。
       1   材料与仪器
       1.1   药品与试剂复方红豆杉胶囊（重庆赛诺生物药业股份有限公司，批号：090301）；硫酸鱼精蛋白注射液（上海第一生化药业有限公司，批号：080102）；新洁尔灭（南昌白云药业有限公司，批号：080501）；水合氯醛（国药集团化学试剂有限公司，批号041210）；丙酮（南京化学试剂厂，批号：990407）；甲醇（江苏汉邦科技有限公司）。
       1.2  动物清洁级雄性SD大鼠，体质量（200±20）g，由浙江省实验动物中心提供（许可证号：20080033）。新鲜种蛋，产出两天内用于实验，蛋重50～60 g，由南京市六合区黄木桥孵化场提供。
       1.3  仪器AIR TECH超净工作台（苏净集团安泰公司）；Forma series ⅡCO2培养箱（美国Thermo公司）；光学显微镜（重庆光学仪器厂）。
       2  方法
       2.1  含药血清的制备清洁级雄性SD大鼠，常规饲养。复方红豆杉胶囊低剂量和高剂量分别按成人（60 kg）体重的6倍（180 mg/kg）和12倍（320 mg/kg）灌胃给药,空白血清组大鼠每天灌胃相同体积的蒸馏水。以上各组灌胃1次/d，连续灌胃7 d。于末次灌胃2h后，水合氯醛麻醉（35 mg/kg），腹主动脉取血，3 000 r/min，10 min离心，取上层血清。无菌滤器（直径0.2 μm）过滤除菌，密封，-20℃保存。
       2.2  CAM模型的制备
       2.2.1  种蛋的孵育选择产出2d内的新鲜种蛋，先用温水清洗2次，再用1∶1000的新洁尔灭清洗表面，最后在超净台内用75%酒精擦拭表面，放入无菌培养箱孵育，设定温度在37℃，湿度在40%～60%。种蛋大头朝上，45°倾斜。为促进羊膜运动，防止胚胎发生粘连，每天翻蛋4次。
       2.2.2  鸡胚的检查使用聚光灯源，自制照蛋灯。每天观察胚胎发育情况，随时淘汰未受精、死胎及胚胎发育不良的种蛋。
       2.2.3  假气室的制备种蛋孵育至第7天，无菌条件下，在种蛋气室端打一个1～2 mm的小孔，滴加50 μl生理盐水使鸡胚绒毛尿囊膜下陷，洗耳球从小孔处吸气，使鸡胚绒毛尿囊膜与壳膜分离，用弯头镊剥去蛋壳开窗（约1.0 cm×1.0 cm），去除壳膜，制成假气室。用灭菌透明胶密封开窗处，继续孵育24 h。
       2.3  药物对CAM的作用随机分为生理盐水组，硫酸鱼精蛋白组，空白血清组，复方红豆杉胶囊低高剂量组5组。开窗24 h后，超净台内揭去透明胶，将灭菌好的擦镜纸片作为载体放在CAM的血管最少处，每枚种蛋加药量为10 μl，将其轻轻加到载体上。加药后，用透明胶封闭窗口，标记后继续孵育。48 h后，记录鸡胚存活率，揭去透明胶，固定液（乙醇∶丙酮1∶1）固定15 min，以载体为中心，剪下CAM，水中展开后，铺于滤纸上，拍照，显微镜下观察血管数。以载体为中心，1 mm以内为一级血管，5 mm内为二级血管，一、二级血管分别观察分析。
       2.4  统计学方法 数据以±s表示，进行组间t检验。
       3  结果
       3.1  复方红豆杉胶囊对鸡胚存活率的影响
       复方红豆杉低、高剂量组血清作用于CAM后，对鸡胚的存活率未见明显影响。结果见表1。表1  复方红豆杉胶囊对CAM模型存活率的影响（略）
       3.2  复方红豆杉胶囊对CAM血管形态的影响 
       实验结果见图1，生理盐水组和空白血清组血管生长正常，硫酸鱼精蛋白组、复方红豆杉胶囊低、高剂量组血管计数明显减少，血管颜色苍白、变浅，载体放置部位无血管生成。
       3.3  复方红豆杉胶囊对CAM血管生成的影响 
       结果见表2。硫酸鱼精蛋白组、复方红豆杉胶囊低、高剂量组明显抑制血管的生成，与生理盐水组、空白血清组相比，有显著性差异（P<0.01）。表2  复方红豆杉胶囊对CAM血管生成的影响（略）
       4  讨论
        血管生成是指从已存在的血管中长出新的毛细血管的过程。肿瘤的生长和转移都依赖于新生血管的形成。新生血管为肿瘤的生长提供营养和排出废物，刺激肿瘤生长，促使肿瘤向其他组织器官转移。原发灶血管数量的增多，增加了肿瘤转移的可能性，即新生血管形成与肿瘤的转移倾向呈正相关。因此，抑制肿瘤血管生成已成为近年来控制肿瘤生长和抗肿瘤转移研究中的热点之一。
        复方红豆杉胶囊由红豆杉、红参、甘草三味中药组成。红豆杉的提取物紫杉醇是治疗转移性卵巢癌和乳腺癌的有效药物之一。研究表明紫杉醇对血管生成有很强的抑制效应，证实紫杉醇是一种血管生成抑制因子［4］。紫杉醇能够明显抑制裸鼠肝癌的血管生成，是一种极其有效的化疗药物［5］。其作用机理可能是通过与微量蛋白结合，促进其聚合，抑制细胞的有丝分裂，有效地阻止肿瘤细胞的增殖。红参是人参的加工品之一，其主要抗肿瘤成分是人参皂苷。人参皂苷Rg3可以对CAM血管生成有显著的抑制作用［6］。人参皂苷Rg3联合紫杉醇为主化疗具有协同抗肿瘤作用，尤其在稳定肿瘤方面优势明显［7］。人参皂苷Rg3可能通过抑制碱性成纤维细胞生长因子的产生，以抑制肿瘤血管的生成，也可诱导肿瘤细胞凋亡，抑制肿瘤生长［8］。甘草性平，味甘，归十二经，有解毒、祛痰、止痛、抗癌等药理作用。现代研究表明，甘草酸、甘草黄酮对宫颈癌、乳腺癌、胃癌、肝癌有抑制其增殖作用［9］。其抗肿瘤的可能机制为通过增加免疫细胞数量来抑制肿瘤的生长，但未见有抑制血管生成的报道。三药联合应用，抑制血管生成，增强免疫力。本实验研究通过观察复方红豆杉胶囊对CAM模型血管生成的影响，证明了复方红豆杉胶囊具有明显的抑制新生血管的生成，间接证明了其对恶性肿瘤的治疗作用，相关机制尚有待进一步探讨。
       【参考文献】
         　　［1］谭永忠,李 静,李忠友,等.复方红豆杉胶囊治疗中晚期恶性肿瘤临床观察［J］.重庆医学,2002,31(6):525.
       
       ［2］刘琳琳,胡志敏.复方红豆杉胶囊配合肺积消1号方治疗老年晚期肺癌32例［J］.实用中医内科杂志,2008,22(3):23.
       
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       ［6］耿怀成,陈龙帮,楮晓源.人参皂苷Rg3抗血管形成作用的实验研究［J］.医学研究生学报,2001,14(4):193.
       
       ［7］袁国荣,叶再元.中药血管抑制剂人参皂苷Rg3联合紫杉醇治疗胃癌术后肝转移的研究［J］.中华中医药学刊,2008,26(4):884.
       
       ［8］张 荣,赵 翌,刘基巍,等.人参皂苷Rg3诱导小鼠肝癌细胞凋亡及抑制肿瘤血管内皮生长因子生成的研究［J］.时珍国医国药,2007,18(1):130.
       
       ［9］马 淼,周旭莉,户元林,等.乌拉甘草有效成分对人体4种肿瘤细胞增殖与凋亡的影响［J］. 时珍国医国药,2008,19(1):9.