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       【摘要】 
       目的研究高效、灵敏、快速的检测葛根素的新方法。方法高效液相色谱与化学发光分析联用。结果方法的线性范围为1.8～180μg·L-1；相关系数为0.999 5；检出限为0.8 μg·L-1；相对标准偏差为2.89%（n=11）。结论此法操作简单，实验时间短，灵敏度高，用于实际样品分析，检测结果准确。
       【关键词】  高效液相色谱； 化学发光检测； 葛根素
        葛根为豆科植物野葛的干燥根，是卫生部颁布的“既是食品,又是药品”的药用植物之一［1］。葛根常用于高血压病、冠心病、心绞痛等疾病的治疗，在机体抗氧化、降低血粘度、防治老年痴呆症、抗癌、治疗酒精依赖等方面也有显著作用［2］，葛根素是葛根的主要药理活性有效成分，为一种异黄酮化合物，其分子结构见图1［3］。葛根素的检测对控制葛根及复方葛根合剂的产品质量具有十分重要的意义。目前,对葛根素的测定方法主要有紫外分光光度法、薄层色谱法、高效液相色谱法、高速逆流色谱法和毛细管电泳-电化学检测法等［4］，尚未见高效液相色谱与化学发光分析联用检测葛根素的报道。
        化学发光分析因为具有灵敏度极高、仪器设备简单、线性范围宽和分析速度快等突出优点而备受关注［5］。化学发光检测技术与高效液相色谱相结合,能克服化学发光选择性差的弱点,因而使得HPLC-CL成为一种有效的痕量及超痕量分析技术［6］。研究发现,葛根素对Luminol-K3Fe(CN)6化学发光体系具有很强的增敏效果，在一定浓度范围内，葛根素浓度与相对发光强度呈线性关系,在C18反相键合相为色谱柱,KH2PO4-CH3OH-H2O为流动相的条件下,基线稳定,脉动小,且使葛根素能达到基线分离。基于此,建立起葛根素的HPLC-CL分析新方法。方法的线性范围为1.8～180μg·L-1；相关系数为0.999 5;检出限为0.8μg·L-1;相对标准偏差为2.89% (n＝11);样品检测结果与UV检测结果相吻合。本法操作简单,实验时间短,灵敏度高,检出限比已报道的高效液相色谱与紫外分光光度检测联用检测葛根素要低2～3个数量级［7］
       1  仪器与材料
        LC-6A型高效液相色谱仪(Shimadzu,日本);BPCL微弱发光测量仪（中国科学院生物物理研究所）;HL-2恒流泵（浙江温州市龙方仪器配件厂）;超声波清洗器;C18色谱柱( id 5.0 mm×300 mm,大连伯瑞色谱中心);鲁米诺储备液:0.01 mol·L–1,称取0.886 0 g鲁米诺（Fluka公司）,加入17.5 ml浓度为1.0 mol·L–1的NaOH溶液,溶解，定容至500 ml,置于4℃冰箱保存;标准品葛根素储备液:0.40 g·L–1,称取标准品葛根素(中国药品生物制品检定所)0.020 0 g,乙醇溶解,定容至50 ml,于棕色试剂瓶保存;K3Fe(CN)6储备液:1.0×10- 3 mol·L-1。其余试剂均为分析纯,实验用均为去离子二次蒸馏水。
       2  方法
        按图2装置操作,流动相使用前经0.45 m滤膜抽滤脱气,待基线稳定后,取标准品葛根素溶液和样品溶液20 μl进样(高效液相色谱仪自带20 μl采样环),记录仪记录化学反应的发光信号,以相对峰高定量。
       3  结果
       3.1  色谱条件的选择
       3.1.1  流动相的选择对一系列CH3OH-H2O、KH2PO4-CH3OH-H2O、CH3OH-CH3COOH-CH3COONa作为流动相的条件进行了优化,发现KH2PO4(0.25mol·L-1)-CH3OH-H2O (10∶15∶75,V/V/V)作为流动相分离效果最好,故以此作为流动相。
       3.1.2  葛根素的色谱行为当高压输液泵泵速为1.0 ml/min,KH2PO4(0.25 mol·L-1)-CH3OH-H2O(10∶15∶75,V/V/V)作为流动相时,浓度为10 μg·L-1的标准品葛根素和样品葛根素色谱图如图3所示,保留时间为6 min,从图3可知葛根素分离效果好。
       3.2  发光条件的选择
       3.2.1  鲁米诺的NaOH浓度的选择鲁米诺与K3Fe(CN)6的化学发光反应要在pH=12的碱性介质中进行，而流动相KH2PO4-CH3OH-H2O为酸性，因此必须增大鲁米诺溶液的NaOH浓度。逐渐增大鲁米诺溶液的NaOH浓度，同步检测混合液的pH值,当鲁米诺溶液的NaOH浓度达到0.02 mol·L-1时，混合液的pH值刚好达到12，其pH也不宜过大，如pH过大，进样和洗脱时检测盘管的pH波动大，空白值随pH值波动也大，误差也随之增大，故鲁米诺的NaOH的浓度选择0.02 mol·L-1。
       3.2.2  鲁米诺浓度的选择Luminol作为化学发光试剂,其浓度高低直接影响化学发光强度。实验中研究了其浓度对化学发光信号的影响(见图4),发现发光强度随着Luminol浓度的增加而增大,但其浓度超过1.0×10-4 mol·L-1时,发光强度随着Luminol浓度的增加而减小,因为Luminol自吸作用。因此,在本实验选择Luminol浓度为1.0×10-4 mol·L-1。
       3.2.3  铁氰化钾浓度的选择K3Fe(CN)6作为氧化剂,其浓度的大小对化学发光强度的影响至关重要。实验发现(见图5),发光强度随K3Fe(CN)6浓度的增加而增大,但当K3Fe(CN)6的浓度超过1.0×10-5mol·L-1时,发光强度随着K3Fe(CN)6浓度的增加而减小,原因是K3Fe(CN)6本身对光有吸收。因此,本实验选择K3Fe(CN)6的浓度为1×10-5mol·L-1。
       3.3  校准曲线、相对标准偏差和检出限在上述选定的实验条件下,葛根素的浓度在1.8～180 μg·L-1范围内与相对发光强度呈良好的线性关系,其线性回归方程为Y=37.34+20.73X (X:μg·L-1); r=0.999 5;对10 μg·L-1的葛根素平行测定11次,其相对标准偏差为2.89%;根据IUPAC建议计算本方法的检出限为0.8 μg·L-1。
       3.4  样品分析将市售野葛根干燥后研细，称取2.00 g粗粉置于索氏提取器中，用200 ml甲醇回流提取5 h，提取液经0.45 m滤膜过滤，得样品溶液。用50 μl进样器进样20 μl进行分离测定，重复测定5次，取均值，并与UV（=254 nm）检测对照，结果见表1，二者相吻合。表1  葛根中葛根素含量测定结果（略）
       4  结论
        综上所述,本文旨在建立高效液相色谱与化学发光分析联用检测葛根素的新方法。实验证明, 本法操作简单,实验时间短,灵敏度高,检出限比已报道的高效液相色谱与紫外分光光度检测联用检测葛根素要低2～3个数量级［7］。本法用于实际样品分析, 检测结果与高效液相色谱与紫外分光光度检测联用检测结果相吻合。
       【参考文献】
         　　［1］国家药典委员会.中国药典，Ⅰ部［S］.北京：化学工业出版社,2000：273.
       
       ［2］王 臻,张 丽,王 炎.葛根研究进展［J］.上海医药,2007,28(10):464.
       
       ［3］刘爱茹,张秀琴.葛根中总黄酮的导数脉冲极谱法测定［J］.药学学报,1987,22(3):208.
       
       ［4］李梅青,盛 旋.反相高效液相色谱法用于葛根黄酮提取物的分离与主要活性成分的测定［J］.分析化学，2003,31（2）：178.
       
       ［5］胡双修，周光明，杨光明.低压离子色谱-化学发光联用在线检测痕量钙［J］.西南师范大学学报（自然科学版），2004，29（2）：255.
       
       ［6］张迎雪,陈福南，章竹君. 高效液相色谱与微超滤技术联用化学发光检测人体血清中的盐酸多巴酚丁胺［J］.分析化学，2004,32（6）：769.
       
       ［7］郭建平,孙其荣,周 全. 高效液相色谱法测定葛根总黄酮及制剂中葛根素的含量［J］.医学实践杂志，1996,14(5)：300.