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       【摘要】 
       目的测定葛根提取物中有效成分葛根素及总黄酮的含量。方法采用高效液相色谱法对其中的葛根素进行含量测定；采用紫外分光光度法对其中的总黄酮进行含量测定。结果葛根素含量在0.017 536～1.753 6 μg范围时与峰面积呈良好线性关系（r=0.999 97），加样回收率为99.50%，RSD为1.36%；总黄酮的线性范围为2.192～10.92 μg·ml-1（r=0.999 55），加样回收率为100.69%，RSD为1.29%。结论所建立的分析方法简便、准确、可靠，重复性好，可用于葛根提取物中葛根素和总黄酮的测定。
       【关键词】  葛根提取物； 高效液相色谱法； 紫外分光光度法
       Study on Determination of Pueraria Flavonoids in Extracts of Pueraria labta (Willd.) Ohwi
       LI Ting, ZHENG Caimei, ZHANG Tong, TAO Jiansheng
       Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, Shanghai 201203, China
       Abstract:ObjectiveTo determine the contents of puerarin and total flavonoids in extracts of Pueraria labta (Willd.) Ohwi. MethodsHPLC was established to determine puerarin, and UV was established to determine total flavonoids in extracts of pueranva Labta. ResultsThe results of HPLC quantitative analysis showed that the linear range of puerarin was 0.017 536～1.753 6 μg(r=0.999 97), and the recovery rate was 99.05%, RSD=1.36%; the results of UV quantitative analysis showed that the linear range of total flavonoids was 2.192～10.92 μg·ml-1(r=0.999 55), and the recovery rate was 100.69%, RSD=1.29%.ConclusionThis method is convenient, accurate, reliable with good reproducibility, so it can be used to determine the contents of puerarin and total flavonoids in extracts of Pueraria labta (Willd.) Ohwi.
       Key words:Extracts of Pueraria labta (Willd.) Ohwi.;  HPLC;  UV
       
       葛根为豆科植物野葛Pueraria labta (Willd.) Ohwi的干燥根，是常用中药材，具有解肌退热，生津，透疹，升阳止泻功效，用于外感发热头痛、项背强痛、口渴、消渴、麻疹不透、热痢、泄泻、高血压颈项强痛等［1］。现代研究证实，葛根中的主要有效成分为葛根素等异黄酮类化合物，具有抗炎解热、扩张冠状动脉血管、增加冠状动脉血流量的作用，同时也有降低血压的作用［2］。本研究在课题组前期研究的基础上，采用水提-壳聚糖澄清-大孔树脂纯化的工艺［3］制备葛根总黄酮提取物，不仅去除了杂质，而且保留了药材中的有效成分，得到的葛根总黄酮纯度大于60%。并且按照确定的工艺进行3批中试放样。结果表明，中试工艺条件稳定。为有效控制产品质量，采用高效液相色谱法对其葛根素含量进行了测定，采用紫外分光光度法对其葛根总黄酮含量进行了测定，为建立葛根总黄酮提取物（有效部位）的质量标准奠定基础。
       1  仪器与材料
           
       Aglient 1100高效液相色谱仪（G1314A型VWD检测器，Agilent ChemStation色谱工作站），HP8453E紫外-可见分光光度计（中国惠普有限公司），XS105DU型电子天平（瑞士梅特勒-托利多公司）。
        
       葛根素对照品（批号：110752-200511 中国药品生物制品检定所），葛根总黄酮提取物（中试产品  批号：0511，0605，0802），甲醇为色谱纯，水为超纯水，其余试剂均为分析纯。
       2  方法与结果
       2.1  葛根素的含量测定
       2.1.1  色谱条件与系统适用性实验色谱柱为Kromasil C18 柱(4.6 mm× 250 mm，5 μm)；流动相为甲醇-水 (26∶74)；流速1.0 ml/min；柱温30℃；检测波长250 nm；进样量20 μl。按上述条件进行含量测定，此条件下，葛根素能与其它组分达到基线分离，与相邻的色谱峰分离度大于1.5，保留时间适中。阴性对照溶液对其含量无干扰。葛根素峰理论塔板数均不小于3 000。结果见图1。
       2.1.2  对照品贮备液配制精密称取葛根素对照品5.48 mg置25 ml量瓶中，加30%乙醇使溶解并定容至刻度，浓度为219.2 μg·ml-1，作为对照品贮备液。
       2.1.3  供试品溶液配制取葛根总黄酮提取物约10 mg，精密称定，置10 ml量瓶中，加入30%乙醇适量，溶解后定容。再从中精密吸取1 ml置10 ml量瓶中，以30%乙醇稀释至刻度，摇匀，0.45 μm微孔滤膜滤过，取续滤液，作为供试品溶液。
       2.1.4  空白溶液的制备取30%乙醇溶液10 ml，0.45 μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。
       2.1.5  线性关系考察分别精密量取“2.1.2”项下的对照品溶液适量，依次稀释，30%乙醇溶液定容，分别配制成0.876 8，2.192，21.92，43.84，65.76，87.68 μg·ml-1的一系列浓度梯度的对照品溶液。分别吸取上述的对照品溶液各20 μl，按“2.1.1”项下条件进行测定。以峰面积积分值为纵坐标Y，葛根素对照品的浓度为横坐标X（μg·ml-1），绘制标准曲线，得回归方程：Y=80.583X-16.705，r=0.999 97。表明葛根素在进样量0.017 536 ～1.753 6 μg范围内，与峰面积呈良好线性关系。
       2.1.6  精密度实验取“2.1.5”项下低、中、高浓度的3个对照品溶液，按“2.1.1”项下条件进行测定。分别连续进样5次，得葛根素的峰面积，计算RSD分别为1.03%，0.29%，0.37%。表明仪器精密度良好。
       2.1.7  样品溶液的稳定性实验取同一供试品溶液，按0，1，2，4，8，12，24 h时间间隔，在“2.1.1”项下条件进行测定，得葛根素峰面积，RSD为0.89%。表明供试品溶液在24 h内稳定。
       2.1.8  重复性实验取同一批样品5次，照“2.1.3”项下方法处理，制备样品供试液。按“2.1.1”项下条件进行测定，得葛根素峰面积，计算其质量分数，结果RSD为0.69%。表明重复性良好。
       2.1.9  加样回收实验精密称取已知含量的样品9份，每份约5 mg，加入不同量的葛根素对照品溶液，按“2.1.3”项下的方法制备供试液，按“2.1.1”项下条件进行含量测定，计算回收率。结果见表1。表1  加样回收率试验结果（略）
         结果表明色谱条件具有较强的可靠性。
       2.1.10  提取物中葛根素含量测定 取3批葛根总黄酮提取物适量，精密称定，按“2.1.3”项下制备，按“2.1.1” 项下条件进行含量测定，测定结果按外标法计算。结果见表2。表2  提取物中葛根素含量测定结果（略）
       2.2  葛根总黄酮含量测定
       2.2.1  供试品溶液的制备取葛根总黄酮提取物约10 mg，精密称定，置10 ml量瓶中，加入30%乙醇适量，溶解后定容。再从中精密吸取1 ml置100 ml量瓶中，以30%乙醇稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液。
       2.2.2  线性关系考察精密量取“2.1.2”项下的对照品溶液0.5，1.0，1.5，2.0，2.5 ml分别置于50 ml量瓶中，加30%乙醇至刻度，摇匀，配制成2.192 ～10.92 μg·ml-1的一系列浓度梯度的对照品溶液。以30%乙醇为空白对照，250 nm处测定吸收度。以吸光度值为纵坐标Y，葛根素对照品浓度为横坐标X（μg·ml-1），绘制标准曲线，得回归方程：Y=13.688X-0.020，r=0.999 55，表明总黄酮含量在2.192～10.92 μg·ml-1范围内，与吸光度呈良好线性关系。
       2.2.3  精密度实验取“2.2.2”项下低、中、高浓度的3个对照品溶液，分别重复测定5次，吸光度的RSD分别为0.03%，0.08%，0.03%。表明仪器的精密度良好。
       
       2.2.4  样品溶液的稳定性实验取同一供试品溶液，按0，1，2，4，8，12，24 h时间间隔，测定溶液的紫外吸光度，RSD为0.40%。表明供试品溶液在24 h内稳定。
       2.2.5  重复性实验取同一批样品5次，照“2.2.1”项下方法处理，制备样品供试液，分别测定紫外吸光度，计算其质量分数，结果RSD为0.20%。表明重复性良好。
       2.2.6  加样回收实验精密称取已知含量的样品9份，每份约5 mg，加入不同量的葛根素对照品溶液，按“2.2.1”项下的方法制备供试液，分别测定紫外吸光度，计算回收率。结果见表3。表3  加样回收率试验结果（略）
       2.2.7  提取物中总黄酮含量测定取3批葛根总黄酮提取物适量，精密称定，按“2.2.1”项下制备供试液，照分光光度法在250 nm处测定紫外吸光度，测定结果按外标法计算。结果见表4。
       表4  提取物中总黄酮含量测定结果（略）
       3  讨论
            　　
       前期实验中发现，不同厂家的葛根样品，葛根素含量相差较大，2005年版《中国药典》规定葛根应为野葛的干燥根，粉葛另为甘葛藤的干燥根，两者的葛根素含量差别较大，为了保证本品临床疗效，故选择野葛投料。
        
       取对照品溶液1.0 ml置25 ml的量瓶中，加30%乙醇至刻度，摇匀，在200～400 nm波长范围内测定葛根素的紫外吸收光谱，结果显示在250 nm处有最大吸收。另取供试品溶液在200～400 nm波长范围内测定紫外吸收光谱，结果也显示250 nm处有最大吸收。同时空白溶剂在此处几乎无吸收，说明溶剂对测定无干扰。因此，选择250 nm作为检测波长。
        
       采用高效液相色谱法和紫外分光光度法测定葛根提取物中葛根素和总黄酮的含量，方法简便、准确、可靠，重复性良好，可为葛根提取物的质量评价提供检测标准。
       【参考文献】
         　　［1］国家药典委员会.中国药典，Ⅰ部［S］.北京：化学工业出版社, 2005: 233.
       
       ［2］李海丽.葛根的现代研究［J］.世界今日医学杂志,2007, 8(1): 57.
       
       ［3］张彤,郑彩美,陶建生,等.水提-壳聚糖澄清-大孔树脂纯化法制备葛根总黄酮工艺研究［J］.时珍国医国药,2008,19(6):1324.