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       【摘要】 
       目的建立一种快速、简便、准确测量鱼腥草中绿原酸含量的方法。方法对鱼腥草根、茎、叶的提取条件进行优化。结果根在30%乙醇浓度条件下，超声25min为提取绿原酸最佳效果；茎在40%乙醇浓度条件下，25min为提取绿原酸最佳效果；叶在40%乙醇浓度条件下，20min为提取绿原酸最佳效果。结论不同产地的鱼腥草中绿原酸的含量差异较大以及不同部位的鱼腥草中绿原酸含量差异很大，为评价其资源的开发利用提供依据。
       【关键词】  高效液相色谱法； 检测； 鱼腥草； 绿原酸
       Determination of Chlorogenic Acid in Different Fractions of Houttuy cordata Thunb. Collected in Various Areas in Guizhou by High Performance Liquid Chromatography
       YANG Zhannan, LUO Shiqiong, PENG Quancai, YU Zhengwen, ZHU Guisheng, YANG Weiping
       1.Key Laboratory for Information System of Mountainous Area and Protection of Ecological Environment of Guizhou Province, Guizhou Normal University, Guiyang Guizhou 550001,China; 2.Guizhou Key Laboratory of Agricultural Biotechnology，Guiyang  Guizhou 550006, China; 3.Guiyang College of Traditional Chinese Medicine, Guiyang Guizhou 550002, China
       Abstract：ObjectiveTo develop a fast, accurate, useful and convenient method for the determination of chlorogenic acid from different organs of Houttuy cordata Thunb. MethotdsChlorogenic acid was extracted from roots, stems, and leaves of the H. cordata .Results The experimental conditions were optimized and the results showed that the best conditions, obtained by preliminary test, were roots: 30% ethanol and 25min ultrasonic extraction, stem: 40% ethanol and 25min ultrasonic extraction, and leaves: 40% ethanol and 20min ultrasonic extraction. Chlorogenic acid in different fractions of Houttuy Cordata Thunb collected in various areas in Guizhou.Condusion The results showed that the contents of chlorogenic acid were different from various areas, and the contents of chlorogenic acid were also different from different organs of H. cordata.Therefore, data were provided for exploiture of resource.
       Key words：HPLC;  Determination;  Houttuy cordata Thunb;  Chlorogenic acid
       
       鱼腥草Houttuynia cordata Thund.又名蕺菜、侧耳根等，属三百草科(Saururaceae)蕺菜属(Houttuynia Thunb.), 因全草带鱼腥味而得名［1］。原产我国，分布于长江以南广大省区，生于背阳山地、林边、田埂及洼地草丛中［2］。全草富含挥发油、鱼腥草素、刺激性蕺菜碱及钾盐［3］。鱼腥草药用价值很高，具有清热解毒、消肿排脓、利尿涌淋作用，还可以提高人体的免疫力［4］。据《中国药典》记载，鱼腥草可治肺炎、肠痈、痢疾、支气管炎、尿路感染、疮疖痈肿等症［5］，同时有很高的食用价值，富含蛋白质、脂肪、碳水化合物、维生素C、矿物质等多种营养成分，维生素含量特别高［6，7］，是一种营养价值极高的野生蔬菜，目前已有人工栽培，已成为一种高档蔬菜［8］。福建、云南、四川、贵州、广东等地开发利用鱼腥草的规模不断扩大，野生资源供不应求，开发利用前景广阔。
        
       鱼腥草是多年生草本植物，野生自然状态下高约30 cm。地下茎节上生根，叶互生卵形，基出五脉，叶柄基部鞘状抱茎。花小，淡黄色或白色，穗状花序顶生，果近球形［9］。
        
       对鱼腥草的有效成分、药理作用和临床应用的研究表明其生物活性较高［10］，由于它既克服了西药的弊端又具有抗菌和抗病毒的持久性，同时资源丰富，使用安全，其临床应用的前景乐观，值得进一步推广应用。
        
       绿原酸(chlorogenic acid，CA)是一种多酚类化合物，由一分子咖啡酸和一分子奎尼酸缩合脱水而成，是植物界广泛存在的一类次生代谢物质，我们运用ChemDraw软件分别构建了绿原酸的分子结构同时使用Chem3D 软件模拟了其3D构象（图1）。研究表明，绿原酸具有抗菌、消炎、解毒、利胆、降压和升高白细胞及显著增加胃肠蠕动和促进胃液分泌等药理作用［11，12］，对大肠杆菌、金色葡萄球菌、肺炎球菌和病毒有较强的抑制作用［13］；对急性咽喉炎症和皮肤病有明显疗效，临床上用于治疗急性细菌性感染疾病及化疗时所致的白细胞减少症，对月经过多，子宫功能性出血有良好的止血效果［14］。除了药用外，绿原酸还可用作抗氧化剂而应用于食品工业。
       绿原酸的测定方法，主要报道的是金银花和杜仲药材上，采用的方法主要是液相色谱法［15］，也有文献用毛细管电泳法测定［16］。鱼腥草中的绿原酸的测定，主要是对鱼腥草制品或制剂中的含量测定，由于制剂中的绿原酸是经过提取加工的，样品中的干扰成分简单，较容易提取，因此，有大量的报道［17,18］，但是对于鱼腥草药材中绿原酸的含量分析，报道的比较少，据我们的现有知识，仅见一篇文献报道了用紫外分光光度计测定鱼腥草中绿原酸的含量［19］。高效液相色谱法分析鱼腥草中绿原酸的含量未见文献报道。目前，人们开始对中药药材的质量标准有新的认识，中药质量控制首先考虑中药材的质量控制。因此，药材中药用成分质量标准也显得非常重要。
         　　
       本文主要对不同产地鱼腥草的不同部位中绿原酸的含量进行分析，通过对绿原酸提取条件的优化以及色谱条件的选择，建立测定鱼腥草中绿原酸含量测定的方法，并通过此方法，对贵州不同产地鱼腥草不同部位的绿原酸含量进行分析，探讨鱼腥草不同产地和不同部位绿原酸的含量变化关系，以期为更好地利用和开发鱼腥草提供理论和实验依据。
       1  药品与仪器
       1.1  药品甲醇(色谱纯)；超纯水；无水乙醇(分析纯)；绿原酸对照品（购于中国生物制品研究所）。
       1.2  仪器岛津高效液相色谱仪（LC-20AT）；20μl进样阀；二级阵列管检测器（PDA-20AT）；岛津色谱工作站（LCsolution）；药材粉碎机；超纯水器(美国Milli2 pore公司)；色谱条件：迪马C18色谱柱(4.6 mm × 250 mm，5μm)；美国ELMA T660/H超声波清洗器(功率360W，频率35 kHz)。
       2  方法与结果
       2.1  样品的采集与处理从贵阳、遵义、铜仁、都匀等地采集鱼腥草（来源见表 1），将其根、茎、叶分开，清洗好后放入恒温箱烘干（50℃），用打粉机将各部分分开打磨成粉末（80目），分装到不同的袋子中备用，在各个袋子上贴上标签，注明其内容物的来源地以及部位。表1  鱼腥草样品的来源及生长环境（略）
       2.2  色谱条件流动相：乙腈:0.1%磷酸溶液=4:6(V/V)；流速为1.0ml/min；柱温40℃； 进样量20μl；检测波长327nm；以色谱峰面积定量。在此条件下，测得绿原酸的保留时间在7.3min 左右，样品溶液中主峰和其它杂峰达到完全分离如图2。
       2.3  提取条件的优化
       2.3.1  不同浓度的乙醇提取称取10份鱼腥草样品每份1.000g（精确到1mg），分别加入不同浓度的乙醇（20ml）称重，超声40min后，称重补足重量损失，离心，取上清液，过0.45μm的微孔滤膜，供上机待测，测定不同乙醇浓度下所提取绿原酸的含量。在不同的乙醇浓度下提取所得的绿原酸峰面积响应值为纵坐标，以不同浓度乙醇横坐标作图（见图 3）。
       2.3.2  不同时间提取称取7份鱼腥草样品，每份1.000g（精确到1mg）编号为1，2，3，4，5，6，7号，在分别加入40%的乙醇（20ml）称重，分别超声5，10，15，20，25，40，60min后，称重补足重量损失，离心，取上清液，过0.45μm的微孔滤膜，供上机待测，测定不同时间所提取的绿原酸在色谱中的响应值。在不同时间下提取所得的绿原酸峰面积响应值为纵坐标，以不同时间为横坐标作图（见图4）。
       2.4  精密度与稳定性试验取浓度为40.5μg/ml的对照品溶液20μl，在上述色谱条件下重复进5次，依据所得峰面积，计算RSD为0.197%；取瓮安家生根供试品溶液，分别在2，4，8，16，24h 进样，依据所得峰面积，计算RSD为2.768%。结果表明，供试品溶液24h内稳定性良好。精密度和稳定性色谱叠加见图5。
       2.5  线性关系考察分别精密吸取绿原酸对照品浓度为8.1，16.2，24.3，32.4，40.5 μg/ml溶液20 μl，在“2.2”项条件下进行测定，以色谱峰面积为纵坐标（Y），以绿原酸的量（μg/ml）为横坐标（X）进行回归，计算回归方程， 绿原酸的回归方程为：Y=83 203X + 18 242，相关系数：R=0.9995，线性范围为：0.162～0.810 μg。不同浓度的绿原酸对照样品的叠加见图6。
       2.6  加样回收率实验精密称取瓮安家生鱼腥草根样品9 份, 每份1.00 g, 3 份为一水平, 分别精密加入“2.2”项下的混合对照品溶液0.5，2，8 ml绿原酸对照品,按供试品溶液制备项下处理, 在“2.2”项下色谱条件下进行分析, 结果绿原酸的平均回收率93.13%, RSD为3.75%。
       2.7  样品溶液的制备精密称取样品粉末1 g左右，置于25 ml容量瓶中，根用30%的乙醇溶液，茎、叶用40%的乙醇溶液定容, 塞紧，超声提取25 min， 静置，取上清液用微孔滤膜过滤，滤液待测。分别精密称取24个批号的鱼腥草粉末，按上述供试品溶液的制备方法和色谱测定条件，测定与鱼腥草各部位绿原酸的含量。结果见表2。表2  鱼腥草样品中绿原酸的含量（略）
       3  讨论
           
       本实验利用超声波效应提取鱼腥草中的绿原酸，采取不同的乙醇浓度进行实验，实验结果表明，在30%的乙醇浓度下鱼腥草根中绿原酸提取效率最高，茎和叶在40%乙醇浓度条件下绿原酸提取最高；同时，对超声提取时间因素进行考察，实验结果表明，鱼腥草根和茎在25 min提取绿原酸为最佳，鱼腥草叶在20 min提取绿原酸为最佳。综合实验结果，提取绿原酸的最佳条件是：根在30%乙醇浓度条件下，超声25 min为提取绿原酸最佳效果；茎在40%乙醇浓度条件下，25 min为提取绿原酸最佳效果；叶在40%乙醇浓度条件下，20 min为提取绿原酸最佳效果。
        
       本实验采用高效液相色谱法测定鱼腥草中绿原酸的含量，方法简便易行，结果灵敏、准确、可靠，可为鱼腥草药材质量标准的制定提供理论依据，具有推广应用价值。
        
       本实验通过对贵州不同地区的鱼腥草绿原酸含量进行分析，并将鱼腥草的根、茎、叶部分分开处理，比较其含量的不同。从图7结果表明：同一地的鱼腥草不同部位的绿原酸含量有很大的差异，不同产地的鱼腥草中绿原酸的含量差异很大；产地不同导致的绿原酸含量的差异，主要因为受气候、土壤、光照等各种因素的影响；不同地区鱼腥草各部位绿原酸的含量也不相同。从鱼腥草各部位绿原酸含量来看，鱼腥草中绿原酸的含量为：根>茎和叶。从不同的地区来看；遵义地区根的绿原酸含量最高，其次是都匀地区，两者都明显高于铜仁地区和贵阳地区。
        
       通过本研究证明，鱼腥草的各部分都具有很高的利用价值。据调查，很多地方食茎不食叶,原因可能是叶的口感不好，但叶也有很大的利用价值，故可将叶进行加工利用，制成保健食品或饮品。有关鱼腥草叶的利用还有待进一步研究。
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