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       【摘要】 
       目的对海蛇干体的化学成分进行分离和鉴定。方法对海蛇干体的活性部位利用硅胶柱层析法和重结晶法进行分离纯化，通过理化常数测定和波谱分析鉴定其化学结构。结果从海蛇干体的醋酸乙酯部位分离得到5个化合物，即胆甾醇（Ⅰ）、1-甲基海因（II）、神经酰胺化合物（Ⅲ）、对羟基苯乙酸（Ⅳ）、对羟基苯乙酸甲酯（Ⅴ）。结论1-甲基海因（II）、对羟基苯乙酸（Ⅳ）、对羟基苯乙酸甲酯（Ⅴ）为首次从海蛇中分离得到，且1-甲基海因（II）为首次从海洋生物中分得。
       【关键词】  海蛇；化学成分
       海蛇药用始载于唐代陈藏器的《本草拾遗》，作为祛风燥湿、通络活血、攻毒和滋补强壮等功效的良药［1］。现代药理研究表明海蛇具有免疫调节［2］、抗菌抗炎［3］、对神经系统影响［4］、抗疲劳等［5］作用。目前，海蛇尚未被《中国药典》（2005版）收载。本实验对海蛇化学成分做了系统研究，在醋酸乙酯部位分离得到5个化合物，经理化常数和波谱数据鉴定为：胆甾醇（Ⅰ）、1-甲基海因（II）、神经酰胺化合物（Ⅲ）、对羟基苯乙酸（Ⅳ）、对羟基苯乙酸甲酯（Ⅴ）。其中1-甲基海因（II）、对羟基苯乙酸（Ⅳ）、对羟基苯乙酸甲酯（Ⅴ）为首次从海蛇中分离得到，且1-甲基海因（II）为首次从海洋生物中分得。
       1  仪器材料
            
       Perkin-Elmer Lambda35 紫外/可见分光光度计；Perkin-Elmer Spectrum One型傅立叶变换红外光谱仪；岛津LC-10ATVP高效液相色谱仪；Bruker Bio TOF Q-ESI质谱仪；Avance Bruker 600兆核磁共振波谱仪；SGW X-4显微熔点仪（上海）；BP211S型（Max220g，d=0.1mg）电子分析天平（德国Sartorius）；RE-5299旋转蒸发仪（郑州）等。柱层析硅胶200-300目（青岛海洋化工厂）；薄层层析硅胶G、H（青岛海洋化工厂）；薄层层析硅胶预制板（德国Merck公司）；乙醇、甲醇、丙酮、正丁醇、醋酸乙酯、石油醚（60～90℃）等均为分析纯。
       
       海蛇购于市场，经成都中医药大学李敏教授鉴定为眼镜蛇科海蛇亚科青环海蛇Hydrophis cyanocinctus（Daudin）和平颏海蛇Lapemis hardwickii（Gray）去除内脏后的干燥体。
       2  方法与结果
       　2.1 提取与分离取去除头部的海蛇干体5 kg，粉碎。用50%的乙醇回流提取，合并提取液，减压回收溶剂得到乙醇提取浸膏。将浸膏用适量水溶解后，依次用石油醚、醋酸乙酯萃取，减压回收溶剂，得醋酸乙酯部位浸膏。取该浸膏30 g，加硅藻土拌匀后减压干燥。经石油醚-醋酸乙酯梯度洗脱和重结晶得到5个化合物，分别为胆甾醇（Ⅰ）、1-甲基海因（II）、神经酰胺化合物（Ⅲ）、对羟基苯乙酸（Ⅳ）、对羟基苯乙酸甲酯（Ⅴ）。
       2.2  结构鉴定
       2.2.1  化合物Ⅰ无色针晶，mp147～149℃，TLC上硫酸烘烤显紫红色，Liebermann-Burchard反应呈阳性。EI-MS m/z：387［M＋1］＋。1H-NMR δ：0.68 (3H，s，H-18)，0.86(d，6H，J = 6.5 Hz，H-26，27 )，0.91 (d，3H，J=6.6 Hz , H-21)， 1.01 (3H，s，H-19) , 3.52（1H，m），5.35 (1H，t) ；13C-NMR δ 37.2（C-1），31.7（C-2），71.8（C-3），42.3（C-4），140.8（C-5），121.7（C-6），31.9（C-7），31.9（C-8），50.2（C-9），36.5（C-10），21.1（C-11），39.8（C-12），42.3（C-13），56.8（C-14），24.3（C-15），28.2（C-16），56.2（C-17），11.9（C-18），19.4（C-19），35.8（C-20），18.7（C-21），36.2（C-22），23.8（C-23），39.5（C-24），28.0（C-25），22.5（C-26），22.8（C-27）。以上数据与文献［6］报道的胆甾醇（Cholesterol）一致，故确定为胆甾醇（Cholesterol）。
       2.2.2  化合物II无色晶体，mp156～157℃。EI-MS m/z：114（M+）。1H-NMR δ：2.91 (3H，s，－CH3)，3.95(2H，s，-CH2-) ；13C-NMR δ157.9（C-2），172.4（C-4），52.5（C-5），27.8（C-6）。数据与合成品1-methylhydantoin一致，确定为1-甲基海因（1-methylhydantoin）。
       2.2.3  化合物Ⅲ白色无定形固体，mp79～82℃。HR-ESI-M：670.6108［M+Na］+，686.5906［M+K］+。1H-NMR δ：0.88（t，2CH3），1.20～1.35（多个亚甲基），2.22（2H，t，J=7.5 Hz），3.70（1H，m，H-1a）、3.90（1H，m，H-2），3.96（1H，m，H-1b），4.31（1H，dd，H-3），5.53（1H，dd，J=15.4 Hz、6.4 Hz，H-4）、5.78（1H，dt，J=15.4 Hz、6.2 Hz，H-5），6.21 (1H，d，J＝7.3 Hz)；13C-NMR δ62.5（C-1），54.5（C-2），74.7（C-3），128.8（C-4），134.3（C-5），173.8（C-1’），36.8（C-2’），29（C-3’）。
       综上所述，神经酰胺化合物骨架的信号与文献资料基本一致，CnHmCH3和C’nH’mCH3为两条亚甲基长链，根据分子式、不饱和度以及1H-NMR低场区信号，可判断其中还存在一个双键。根据目前报道，此类化合物若含双键，则必有一个是4-trans，另一个是8-trans，9-cis，13-cis或14-cis。而化合物Ⅲ的数据与这些类型均不一致。可能为一新的神经酰胺类。为确定其具体结构，将在后续实验中进行一下内容：微量臭氧化作用后，再用三苯基膦分解为醛，测定分解产物质谱，根据碎片离子峰确定双键位置；2D－NMR测试和分析。
       2.2.4  化合物Ⅳ白色晶体，mp149～152℃，具有升华性。三氯化铁-铁氰化钾反应阳性。EI-MS m/z：152（M+），108，107（M+-COOH，100），77，63，51，39。1H-NMR δ 3.48(s,2H), 6.72(d，J＝8.4 Hz，H-2,6), 7.08(d，J＝8.4 Hz，H-3,5)； 13C-NMR δ125.4(C-1)，129.9(C-2,6)，114.8(C-3,5)，156.0(C-4),39.7(C-7)，174.7(C-8)。以上数据与文献［7］报道一致，确定为对羟基苯乙酸（p-hydroxyphenyl acetic acid）。
       2.2.5  化合物Ⅴ黄色油状物，三氯化铁-铁氰化钾反应阳性。EI-MS m/z：166（M+），108，107（M+-COOCH3，100），77，63，51，39。1H-NMRδ3.50(2H，s)，3.69（3H，s）6.78(d，J＝8.4 Hz，H-3,5), 7.10(d，J＝8.4 Hz，H-2,6)； 13C-NMR δ126.6(C-1), 131.6(C-2, 6)，δ116.5(C-3,5)，157.9(C-4)，41.2(C-7)，174.8(C-8)，52.7(C-9)。以上数据与文献［8］报道一致，确定为对-羟基苯乙酸甲酯（methyl  p-hydroxybenzeneacetate）。
       【参考文献】
         　　［1］张黎明，陈志龙.海蛇的药用价值［J］.中医药学报，2002，30（5）：25.
       
       ［2］潘汉杰,周少雄.海蛇乙醇浸出物对小鼠免疫系统的影响［J］.蛇志，2001，13（2）：1.
       
       ［3］任海霞,肖 诚，孔 丽，等.海蛇乙醇提取物对胶原诱导关节炎大鼠滑膜血管生产的抑制作用［J］.中国中医基础医学杂志,2007,13(2):115.
       
       ［4］卫剑文，钟肖芬，彭立胜，等.平颏海蛇CRVP基因全长cDNA片段的克隆和序列分析［J］.中山大学学报,2001,40（4）:5.
       
       ［5］饶颖竹,陈 蓉，肖桂元，等.海蛇乙醇浸出物对小鼠抗疲劳作用的实验研究［J］.蛇志，2003, 15(4):9.
       
       ［6］汤华,程 萍，林厚文，等.总合草苔虫的化学成分研究［J］.中药材,2007,30（6）：655.
       
       ［7］史辑,张芳，马鸿雁，等.千里光化学成分研究［J］.中国中药杂志,2007,32（15）：1600.
       
       ［8］吴 斌,吴立军，张 磊，等.麻叶千里光抗菌化学成分的研究(Ⅰ)［J］.沈阳药科大学学报,2004,21（5）：341.