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       【摘要】 
       目的建立海洋中药干贝高效液相色谱（HPLC）指纹图谱分析方法，为其质量控制和药材鉴别提供依据。方法采用反相Alltima-C18柱，水（A）和乙腈（B）为流动相，梯度洗脱，流速为0.8 ml/min，检测波长210 nm，柱温20℃，进样体积30μl；采用高效液相色谱二极管阵列检测器-质谱联用技术（HPLC-DAD-MS）对其特征峰进行快速分析；采用相似度计算软件用于10批干贝药材的相似度评价。结果初步建立了干贝药材的HPLC指纹图谱，10批干贝药材指纹图谱有9个共有峰，相似度均在0.85以上；HPLC-DAD-MS分析获得的4个特征峰的紫外光谱和质谱信息，可用于干贝药材指纹图谱特征峰以及共有峰的准确确定。结论该方法准确、简单、稳定性好，为干贝药材的真伪鉴别及质量控制提供了科学依据。
       【关键词】  干贝； 高效液相色谱法； 指纹图谱
       Study on HPLC Fingerprint of Chinese Marine Medicine Dried Scallop
       CHENG Hongyan，CHEN Junhui，ZHAO Hengqiang，ZHANG Daolai，SHI Qian1，WANG Xiaoru
       （1. Research Center for Marine Ecology, First Institute Oceanography of SOA, Qingdao, 266061; 2. Department of Chemistry, College of Chemistry and Chemical Engineering, Xiamen University, Xiamen 361005, China）
       Abstract：ObjectiveTo establish a chromatographic fingerprint of Dried Scallop, a kind of Chinese marine medicine, by high performance liquid chromatography (HPLC), and apply for quality assessment and control of medicine materials of Dried Scallop. MethodsSeparation was performed on an Alltima-C18 (250 mm × 4.6 mm, 5μm), with mobile phase consisting of water (A) and acetonitrile (B) with gradient elution at the flow rate of 0.8 ml/min. The UV detection wavelength was 210 nm, column temperature was 20℃. Characteristic peaks of the fingerprint could be rapidly analyzed by high performance liquid chromatography-mass spectrometry (HPLC-MS), and the software of similarity analysis was used to calculate the similarity of all the Dried Scallop samples. ResultsAll samples tested contained the same nine peaks, and the similarities of 10 batches of Dried Scallop were more than 0.85. MS and UV spectra of the 4 characteristic peaks obtained using HPLC-MS could be used to accurately confirm the characteristic and common peaks in fingerprint of Dried Scallop. ConclusionThis method is simple, accurate and stable, and can provide scientific reference for the identification and quality control of Dried Scallop.
       Key words： Dried Scallop; High performance liquid chromatography; Fingerprint
       
       干贝Dried Scallop为扇贝科动物栉孔扇贝Chlamys farreri(Jones et Preston)、华贵栉孔扇贝Chlamys nobilis(Reeve)和花鹊栉孔扇贝Chlamys pica(Reeve)的闭壳肌，经煮熟、干燥后得到的干制品扇贝柱，其鲜嫩味美，是深受消费者喜爱的重要海产八珍之一［1］。干贝之鲜味因干制浓缩，十分峻烈，古人曾说过“干贝峻鲜 ， 无物可与伦比，食后三日犹觉鸡、虾乏味”。这是因为它富含酰胺、肽、谷氨酸和琥珀酸等多种呈鲜物质所致，且含有蛋白质、磷酸钙、维生素A、维生素B和维生素D等多种营养成分，是食补精华［2］。《中华本草》中记载干贝具有滋阴、养血、补肾、调中的功效，具有抗肿瘤、促生长等药理作用；近年来，医学界证明了干贝的药用价值，能作为营养不良调理、补血调理、滋阴调理和益智补脑调理等食疗［3，4］。干贝作为一种重要的海洋中药（海洋保健食品）资源，对其的质量控制国内外至今未见报道。
        
       近年来，由于中药指纹图谱技术可全面反映中药材的药效成分及其相对比例，能有效表征复杂中药的质量，已广泛用于陆源中药原药材及其制品的质量控制［5，6］，而用于海洋药物的鉴别以及质量控制研究还较少［7，8］。最近，本课题组已经成功建立了罗氏海盘车、马粪海胆和海参等海洋中药的高效液相色谱指纹图谱［9，10］。本实验在前期研究的基础上，首次对海洋中药干贝的HPLC指纹图谱进行研究，为干贝的质量控制建立了一种有效的现代分析方法。
       1  仪器与材料
       1.1  仪器1200 型高效液相色谱仪，配有四元泵，二极管阵列检测器（DAD），自动进样器等（美国Agilent公司）；6320型离子阱质谱仪，配有电喷雾（ESI）离子源和大气压化学电离（APCI）源（美国Agilent公司）；KQ-400KDE型高功率数控超声波仪（昆山市超声仪器有限公司）；R201型旋转蒸发仪（上海申生科技有限公司）；FA1104型电子天平（上海精天电子仪器厂）；THZ-8 恒温水浴锅（中国浙江嘉兴电热仪器厂）；Milli-Q(18.2 MΩ) 超纯水处理系统(美国Millipore 公司)。
        
       Alltima-C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm，美国Alltech）；Diamonsil-C18色谱柱 (4.6 mm×150 mm，5 μm，中国Dikma)；Zorbax Bonus-RP C18色谱柱(4.6 mm×250 mm， 5 μm，美国Agilent)；Sinochrom ODS-BP C18色谱柱（4.6 mm ×200 mm，5μm，中国大连依利特）；Eclipse XDB-C18 （4.6 mm×150 mm，5 μm，美国Agilent公司）。
       1.2  材料甲醇、乙腈为色谱纯（德国MERCK公司）；乙酸色谱纯（德国Riedel公司）；磷酸色谱纯（天津瑞金特化学品有限公司）；水为自制Milli-Q超纯水；乙醇为分析纯（烟台三和化学试剂有限公司）；正丁醇为分析纯（天津市科密欧化学试剂有限公司）；醋酸乙酯为分析纯（天津广成化学试剂公司）；氯仿为分析纯 (烟台三和化学试剂有限公司)。
        
       本实验所采用的干贝样品从青岛、烟台、连云港等沿海城市收集，共10批次，编号为S1-S10（见表 1），经中国海洋大学水产学院曾晓起教授鉴定均为正品干贝Dried Scallop。表 1  干贝药材来源（略）
       2  方法
       2.1  色谱分析条件Alltima-C18色谱柱（4.6 mm×250 mm, 5 μm），流动相：水（A），乙腈（B），梯度洗脱程序为T：0～15～20～50 min，流动相比例B%：50%～87%～100%～100%，柱温20℃，流速为0.8 ml/min，检测波长：210 nm，进样量：30 μl。
       2.2  质谱分析条件流动相：0.2% 醋酸水溶液（A），0.2%醋酸乙腈溶液（B）；其他色谱分离条件同上，色谱柱后分流进入质谱的流动相流速：0.4 ml/min，电喷雾离子源，正离子电离模式，雾化气压力：50 psi，干燥气（N2）流速：11.0 L/min，干燥气体温度：350℃，毛细管电压：4 000 V，全扫描(Scan)质荷比（m/z）范围：120～1 000。
       2.3  样品溶液的制备将干贝样品60 ℃烘干6 h，粉碎，过40目筛备用。准确称取1.00 g干贝粉样品，置于100 ml具塞锥形瓶中，加入30 ml正丁醇、乙醇混合液（V∶V=4∶1），在室温条件下超声提取30 min，静置30 min，取上清液于100 ml旋蒸瓶中，在80 ℃ 条件下旋转蒸发浓缩至干，用乙腈溶解提取物并定容至5 ml，过0.45 μm微孔滤膜后作为供试品溶液。
       3  结果
           
       以干贝药材的9个共有峰 (1～9号峰，见图 1)的相对保留时间及相对峰面积来考察仪器精密度、实验方法的重复性及稳定性。
       3.1  精密度实验取
       S1号样品的供试品液，按照“2.1”项色谱分析条件，重复进样5 次测定，记录指纹图谱，结果表明，各共有峰的相对保留时间和相对峰面积比值无明显变化，RSD值分别为0.06% ～0.14%和1.50%～3.73%，符合指纹图谱要求。
       3.2  重复性实验
       取 S1号样品6份，制备供试品溶液，按照“2.1”项色谱分析条件进样分析，记录指纹图谱，结果表明，各共有峰的相对保留时间和相对峰面积比值无明显变化，RSD值分别为 0.11% ～0.17%和2.79%～6.68%，符合指纹图谱要求。
       3.3  稳定性实验取
       S1号样品的供试品液，按照“2.1”项色谱分析条件，分别在 0，3，6，8，12，24，48 h进样分析，记录指纹图谱，结果表明，各共有峰的相对保留时间和相对峰面积比值无明显变化，RSD分别为 0.11% ～0.80%和2.10%～4.90%，显示供试品溶液至少在 48 h稳定，符合指纹图谱要求。
       3.4  样品的指纹图谱测定分别取不同批次的干贝样品10个，按供试品溶液的制备方法获得供试品溶液，按照“2.1”项色谱分析条件进行分析，记录各批次干贝样品的指纹图谱（见图 1），通过对不同样品图谱的比较，选择稳定性好、吸收强、特征明显的色谱峰为共有峰，确定9个峰为干贝药材指纹图谱共有峰。其中9 号峰化学性质稳定，保留时间以及峰面积重复性良好，与其它相邻峰分离良好，采用化学工作站计算该峰的纯度，表明该峰为一纯化合物，因此选择9号峰为参照峰（保留时间和峰面积均设为1），用于计算各共有峰与内参峰的相对保留时间（见表 2）及相对峰面积（见表 3），各样品的各共有峰相对保留时间RSD均小于 0.11%，更进一步说明本方法的可靠性。统计共有峰与总峰面积的百分比，结果表明，共有指纹峰的峰面积百分比大于 90%，符合指纹图谱研究的>90%的检测要求。表2  10批干贝药材样品中各共有峰的相对保留时间（略）表3  10批干贝药材样品中各共有峰的相对峰面积（略）
       3.5  特征峰的准确定位在本研究所建立的分析系统下，干贝提取物成分出峰时间主要在35 min之前，包含9个共有峰，其中特征性最为明显的有4 个色谱峰，这4 个色谱峰即构成干贝HPLC指纹图谱的特征峰（分别为峰1，2，8，9；见图 1），用于干贝药材HPLC指纹图谱共有峰的快速准确识别和定位。采用高效液相色谱-电喷雾质谱联用技术（HPLC-ESI-MS）对干贝指纹图谱中的特征峰进行分析，HPLC工作条件同“2.1”项色谱条件，ESI-MS按照“2.2”项质谱条件进行检测分析，获得的质谱总离子流色谱图（TIC），如图2所示，可以看出干贝的正丁醇、乙醇混合溶剂提取物中各特征峰质谱分析信号良好，干贝指纹图谱中的4 个特征峰的质谱图及DAD光谱图（图3）。查阅国内外干贝化学成分研究的相关文献及相关天然产物化学成分数据库，发现干贝指纹图谱中的4 个特征峰可能为没有文献报道的新化合物；根据 HPLC-ESI-MS获得的4 个特征峰的质谱图及DAD光谱图，结合4个特征峰的保留时间，可以实现干贝药材指纹图谱特征峰以及共有峰的快速准确定位，对干贝HPLC指纹图谱用于干贝药材的真伪鉴别具有重要意义。
       3.6  相似度计算 10批干贝样品分别购买于沿黄、渤海不同城市，样品的代表性较好。通过“中药色谱指纹图谱相似度评价系统 ”(《中国药典》2004A版 ) 对10 批干贝药材的指纹图谱进行相似度分析，首先将色谱工作站数据导入中药指纹图谱相似度计算软件，选定上述 9 个共有峰进行谱峰匹配， 通过中位数矢量计算得出干贝样品指纹图谱的共有模式（见图1），并以此共有模式为对照模版（参考指纹图谱），用于10批干贝药材相似度评价，相似度评价结果均大于0.85（见表4），说明这10批干贝药材的化学成分一致性较好。由相似度计算结果可以看出，S3样品指纹图谱与共有模式的相似度高达0.984，因此，S3样品的指纹图谱也可以作为干贝药材的参考指纹图谱（见图4），具有较好的代表性和科学性，而S3样品则可以作为干贝药材的标准物质，用于干贝药材的HPLC指纹图谱质量评价。表4  10批干贝药材的相似度计算结果（略）
       4  讨论
       4.1  提取溶剂与提取方法的选择本研究对5种不同提取溶剂及其混合液（甲醇、乙醇、醋酸乙酯、正丁醇、氯仿）制备干贝提取物进行了比较，结果表明，干贝不同溶剂提取物HPLC指纹特征差异显著，乙醇、正丁醇混合液提取物HPLC指纹图谱效果最好，且正丁醇、乙醇混合液既能提取出干贝中不同极性的小分子物质，提取液无需经过去除蛋白、脱盐等过程便可直接进样检测，且该提取溶剂相对毒性较小、价格便宜，因此选择正丁醇、乙醇混合液做干贝HPLC指纹图谱制备提取溶剂；另外，还对不同比例正丁醇、乙醇混合液进行了比较，结果表明，正丁醇、乙醇体积比为4∶1的混合效果最佳。此外，还对超声波提取法、水浴加热法、回流提取法进行了比较，结果表明，以正丁醇、乙醇混合溶剂（V∶V=4∶1）进行回流提取和水浴加热提取效果不理想，原因可能是两种溶剂混合提取时，沸点相差较大，低沸点溶剂挥发损失大，较高沸点溶剂则因提取温度过低无法沸腾。最终选择超声提取法，超声提取过程中，温度发生一定波动，经考察对实验基本没有影响，故提取过程中无需严格控温。在以上最佳条件下，提取一次即可获得较为理想的提取效率，故无需多次提取。
       4.2  检测波长的选择通过二极管阵列检测器全波段扫描（190～400 nm），考察了不同检测波长对指纹图谱的影响，结果表明，在UV 210 nm条件下检测获得的色谱指纹图谱信息量大，指纹峰特征性强，具有较好的代表性，因此选择210 nm作为干贝HPLC 指纹图谱研究的检测波长。
       4.3  色谱柱与流动相的选择干贝成分复杂含有丰富的蛋白质、脂肪、维生素、微量元素等营养成分［3］，采用等度洗脱的方法很难将干贝提取物中的多种化合物分离开，因此采用线性梯度洗脱方式进行分离。本研究对“仪器”中所列的5 根不同生产厂家的色谱柱进行了比较，结果表明，使用Alltima-C18色谱柱获得的干贝提取物指纹图谱各峰分离度高，色谱峰分布均匀，峰型好看，具有较好的代表性，因此选择Alltima-C18 柱用于干贝药材的指纹图谱研究。在此基础上，比较了甲醇、乙腈、水为流动相时的色谱图效果，并加入磷酸、乙酸调节流动相pH以改善分离度和色谱峰形，结果发现以水-乙腈为流动相时，进行梯度洗脱50 min，可以使全部色谱峰流出，并且色谱峰的分离度较好。
       4.4  质谱条件的考察本研究比较了ESI-MS和APCI-MS两种质谱技术，结果发现，干贝的正丁醇、乙醇混合溶液提取物在APCI-MS正、负模式下均几乎没有响应，而在ESI-MS正离子模式下，大部分化合物均能产生质谱信号，说明提取物中化合物的极性偏高，ESI-MS正离子模式适用于干贝化学成分的分析。
       4.5  小结本文采用HPLC法，建立了干贝的HPLC指纹图谱，结合相似度分析可用于干贝药材的真伪鉴别及质量控制。此外，应用HPLC-ESI-MS联用技术，成功对干贝指纹图谱的4个特征峰进行了紫外光谱和质谱表征，提高了HPLC指纹图谱作为干贝药材真伪辨别与质量控制准确性和特征性，也为今后对干贝的活性化学成分的鉴别提供了方法学依据。通过HPLC指纹图谱可以比较全面地反映干贝药材的化学成分以及各特征性成分间峰面积的相对比例，进而反映干贝药材的内在质量,为干贝药材判断真伪、评价优劣、考察稳定性和一致性提供依据。本实验中所建立的测定方法快速准确，灵敏度高，可作为干贝质量控制和应用的依据以及中药研究的方法学借鉴。
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