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       【摘要】 
       目的观察加味四君子汤和思密达对小鼠肠道免疫功能的调整作用。方法盐酸林可霉素灌胃建立小鼠肠道菌群失调及免疫功能紊乱模型。昆明种鼠随机分6组，正常对照组、自然恢复组、造模组、思密达组、加味四君子汤组和两药合用组，分别进行肠道菌群检测、小肠黏液中sIgA的测定、血清中IL-2的测定及肠通透性(尿液中乳果糖与甘露醇比值)的检测。结果盐酸林可霉素灌胃3 d小鼠，肠道菌群失调，sIgA从正常对照组的14.54 mg/ml增加到18.70 mg/ml，IL-2从正常对照组的1 186.65 mg/ml降低到1 111.58 mg/ml、L/M从正常对照组的1.27增加到1.37 mg/ml。实验组分别给加味四君子汤、思密达及两药合用后，肠道菌群得以调整，sIgA含量从18.70 mg/ml降低到14.52 mg/ml，IL-2的含量从1 111.58 mg/ml增加到1189.58 mg/ml，肠黏膜通透性减小。各治疗组间比较，加味四君子汤和思密达合用组优于加味四君子汤组和思密达组。结论加味四君子汤和思密达均能修复受损黏膜，有调节肠道免疫功能的作用，但加味四君子汤在调整失调的菌群方面优于思密达，两药合用给药则能起到最佳效果。
       【关键词】  肠道菌群； 加味四君子汤； 肠道免疫； 肠通透性
        正常肠道屏障功能依赖于肠黏膜上皮屏障、肠道免疫系统以及肠道的正常微生物的平衡［1］。近年来，很多学者开始研究四君子汤对肠道菌群的调整作用，鞠宝玲、李俭等［2，3］研究表明四君子汤可以改善脾虚大鼠胃肠黏膜的异常形态，使其恢复正常，并对双歧杆菌和乳酸杆菌有明显的增菌作用，从而调节肠道菌群失调，治疗由肠道菌群失调导致的一系列疾病 ，李莉等［4］研究了加味四君子汤对肠道菌群失调小鼠的调整作用，效果显著。本文探讨山药加入四君子汤对肠道菌群的调整及机体免疫功能的调整作用。
       1  材料与仪器
       1.1  动物清洁级昆明种小鼠（合格证号：SCXK 2005-0001），体质量18～22 g，雌雄各半，由河南省实验动物中心提供。
       1.2  药物与试剂盐酸林可霉素（300 g/L）, 上海旭东海普药业有限公司，批号：070509；思密达，博福-益普生制药有限公司，批号：S0293；中药：人参、山药、白术、茯苓、甘草，购于张仲景大药房，将上述中药按2∶2∶2∶2∶1混合，水提取，过滤浓缩至1 g/ml生药量；生理盐水，山东鲁抗辰欣药业有限公司；乳果糖（辽宁省丹东市康复制药厂）；甘露醇（北京化工厂，进口分装）；甲基甘露糖苷（SIGMA）；吡啶（FLUKA）；羟基盐酸盐（SIGMA）；n-三甲基硅烷咪唑（SIGMA）
       1.3  培养基EMB（伊红美兰培养基），用于肠杆菌的分离培养；EC（肠球菌选择性培养基）；LBS（乳酸杆菌选择性培养基）；BD（类杆菌选择性培养基）；Blb（双歧杆菌选择性培养基），培养基的配制参考文献［5］。
       1.4  仪器设备酶标仪(BIO-RAD  Model 680)；气相色谱（FULI  GC 9790II）配有FID检测器，微机色谱数据处理系统SE-54，15 m×0.53 m×0.5 μm毛细管柱。色谱分析条件：SE-54，15cm×0.53 m毛细管柱。初温150℃，程序升温I终温220℃，速率10℃/min,程序升温II终温280℃，速率15℃/min，保持6 min,注样器的温度220℃，检测温度300℃。载气（高纯氮）30 ml/min,燃气（氢气）30 ml/min，助燃空气300 ml/min。
       2  方法
       2.1  动物分组、造模［3］及给药方法昆明种小鼠72只，体质量18～22 g，雌雄各半。随机取出12只作为正常对照组，其余用盐酸林可霉素（300 mg/ml）灌胃，每次0.3 ml，2次/d，连续3 d，正常对照组灌等量生理盐水。随机取出12只作为模型组，立即处死，进行各种指标检测。然后将剩余的48只随机分为4组，分别灌以生理盐水、思密达、加味四君子汤、及两药合用。中药组和生理盐水组，0.3 ml/次，2次/d，连续6 d；思密达组（0.06 g/ml）， 0.2 ml/次，2次/d，连续10 d。各治疗组及正常对照组给药完成后处死小鼠，采集标本进行各种指标检测。
       2.2  肠道菌群检测无菌采取小鼠鲜粪便约0.2 g置于灭菌后带玻璃珠的青霉素小瓶，加灭菌生理盐水制成10倍的稀释度，振荡使之均质化，递10倍稀释至10-6，取25 μl分别接种在各类选择性培养基上，培养EMB培养基及EC培养基 放入需氧环境35℃培养16～24 h后计数，BLb培养基、LBS培养基和BD培养基放入厌氧环境35℃培养48～72 h之后计数［6］。根据菌落形态，涂片分析及耐氧实验结果计算各菌群每克粪便中菌落形成单位（CFU /g）。
       2.3  小肠粘液sIgA测定取紧靠回盲部小肠肠段4 cm，平铺于滤纸上，纵向剖开刮取肠道内容物及粘液于EP管中，加入1 ml PBS充分匀浆，4 000 r/min，30 min，取上清，按ELISA试剂盒说明书进行粘液sIgA的测定，在450 nm处读取相应的A值。
       2.4   IL-2测定收集眶后血管丛血液置于Eppdeffer管，37℃温箱中放置1 h，4 000 r/min离心，取血清置于-80℃冰箱中保存，按试剂盒说明书进行血清IL-2的测定。
       2.5  L/M的测定［5，7］ 将乳果糖200 mg，甘露醇100 mg加入10 ml生理盐水中配成混合溶液，以0.5 ml/只剂量灌胃。收集服糖后6 h尿液，置-20℃冷冻保存备用。取待测尿样100 μl加入试管内，然后加125μl内标液，在充氮气容器内干燥，再加100 μl肟溶液（1ml吡啶中加入25mg羟基盐酸盐）75℃30 min，再加100  μl n-三甲基硅烷咪唑75℃15min，冷后取2μl进行色谱分析。
       3  结果
       3.1  肠道菌群的定量检测见表1。小鼠经盐酸林可霉素灌胃后，与正常对照组相比，5种肠道菌群发生显著变化，其中双歧杆菌、乳酸杆菌、肠杆菌数量显著降低，而肠球菌、类杆菌数量有所升高。经各组治疗后，各种细菌基本恢复到正常水平，其中加味四君子汤组效果最好，与正常对照组已无差异（P＞0.05）。表1  小鼠经盐酸林可霉素灌胃和药物处理后肠群检测结果(略)
       3.2  sIgA和IL-2的测定结果见表2。小鼠经盐酸林可霉素灌胃后，sIgA增高，IL-2降低，经加味四君子汤和思密达治疗后，sIgA和IL-2的含量趋于恢复到正常水平，其中以加味四君子汤和思密达组恢复的最好。
       3.3  尿液中L/M的测定正常对照组的小鼠尿液中L/M的峰面积比值为1.27（54 494.88±1 269.08/42 973.02±1 266.39）。结果见图1，而灌胃3 d盐酸林可霉素后，L/M的峰面积值升高到1.37（58 894.883±1 627.90/42 988.966±741.20）。见图2。表2  小鼠经盐酸林可霉素灌胃和药物处理后小肠黏液sIgA和血清IL-2含量测定结果(略)
       4  讨论
        乳果糖通过小肠黏膜上皮细胞的紧密连接处吸收，乳果糖的吸收与小肠黏膜上皮细胞的紧密连接完整程度成反比；甘露醇通过小肠上皮细胞膜上的水溶性微孔吸收。两者在小肠内不代谢，直接吸收入血，然后由尿中排出，可从尿中进行定量测定其吸收量。如果尿中L/M的值升高，即表明上皮细胞间的结构已发生改变，黏膜的通透性增加。本文结果表明，小鼠经盐酸林可霉素灌胃后，L/M值增高，黏膜有损。经加味四君子汤和思密达治疗后，L/M值又降低到正常水平，黏膜的通透性降低。黏膜通透性降低表明破损的黏膜已经基本得到修复，这与肠道菌群的调整也有很多关系。近年来，国外学者［7］采用多种糖来检测胃肠道黏膜的通透性，其中比较常见的为三氯蔗糖，它可以全面反映胃肠道的通透性，对于其在本实验中的应用还有待于进一步研究。
         IL-2是参与免疫应答的重要细胞因子，并参与炎症反应。sIgA参与机体局部免疫，在呼吸道、消化道黏膜防御机制中发挥重要作用［8］。梁庆红等［9］用卡那霉素50 mg 小鼠灌胃，连续10 d，建立了小鼠肠道菌群失调模型，观察到血清IL-2 、IL-3的含量低于对照组。刘崇海等［10］ 给小鼠口服头孢哌酮7 d后经口给予白色念珠菌，诱导肠道菌群失调，检测脾指数、PHA 诱导的淋巴细胞转化率、迟发型变态反应、抗体生成细胞数和脾脏的TLR2 和TLR4 基因表达水平均低于对照组。石梅等［11］用盐酸林可霉素、头抱哇林钠及氨节西林钠混合液（各药浓度均为100 mg/ml）小鼠灌胃， 0.2 ml/只，2次/d，连续3 d，小鼠肠道菌群失调后导致其免疫器官指数, 血清免疫球蛋白IgA，IgM，IgG含量, 淋巴细胞转化率和单核一巨噬细胞吞噬率均极显著下降 。这些研究表明，菌群紊乱可引起机体免疫功能低下或紊乱。本文结果表明，经盐酸林可霉素灌胃后，小鼠血清IL-2含量降低，与上述结果一致；小肠黏液sIgA含量增高，可能与本文抗菌药用量相对低和时间短，紊乱菌群刺激肠道局部黏膜免疫系统，sIgA 分泌量增加有关。
        本实验应用盐酸林可霉素造成小鼠肠道菌群失调，其中肠道有益菌双歧杆菌和乳酸杆菌，及肠杆菌数量下降，而类杆菌和肠球菌数量升高。小肠黏液中sIgA的含量增高，血清中IL-2含量降低，尿液中L/M的比值增高，这些变化均显示小鼠肠道的局部屏障功能和全身免疫功能紊乱。经加味四君子汤调整后，肠道菌群基本恢复正常；思密达组对肠道菌群的调整作用效果不明显，但对肠黏膜的修复效果较好。加味四君子汤和思密达合用组无论是在对肠道菌群的调整方面，还是在调整肠道免疫功能方面都有较好的效果。这提示在应用抗菌药物的同时，可适当加服一些能对肠道菌群有调整作用和对肠道免疫功能有调整作用的制剂，预防内源性感染。
       【参考文献】
         　　［1］Hecht G..Innate mechanisems of epithelial host defense;spotlight on intestine［J］.Am J Physiol,1999,277:C351.
       
       ［2］鞠宝玲，陆 叶，唐小云，等.四君子汤及其纳米制剂对微生态失调小鼠的调整作用［J］.中国微生态学杂志，2007，19(1):6.
       
       ［3］李 俭，王 琳，杨景云，等.四君子汤对免疫抑制小鼠肝脏细菌易位的影响［J］.中国微生态杂志，2005，17（2）：102.
       
       ［4］李 莉，白晓玲.加味四君子汤对失调小鼠肠道菌群的调整作用［J］.中华临床医学研究杂志，2007，13（7）：850.
       
       ［5］祝小枫，熊德鑫，盛志勇，等.肠通透性改变的检测，第1版［J］.解放军医学杂志，1997，22（2）：150.
       
       ［6］罗 予，冯羡菊.临床厌氧菌检测及图解［M］.北京：中国协和医科大学出版社，2007：74.
       
       ［7］Ashkan Farhadi, Ali Keshavarzian, Jeremy Z. Fields, Maliha Sheikh, Ali Banan .Resolution of common dietary sugars from probe sugars for test of intestinal permeability using capillary column gas chromatography［J］.Journal of Chromatography B,2006，836（1～2）：63.
       
       ［8］Bulberg R S, Strober W. Prospects for research in inflammation bowl disease［J］.J A M A, 2001,285(5):643.
       
       ［9］梁庆红，张 琳，段恕诚，等.肠道菌群失调对小鼠免疫和造血功能状态的影响［J］.中华儿科杂志，2004，42（9）：708.
       
       ［10］刘崇海，杨锡强，刘恩梅，等.抗生素诱导小鼠肠道菌群失调对免疫功能和Toll 样受体2、4 基因表达的影响［J］.重庆医科大学学报，2007 ，32 （8）：839.
       
       ［11］石 梅，彭广能，钟志军，等 .思密达对实验性小鼠肠道菌群及免疫功能影响的研究［J］.黑龙江畜牧兽医，2007，11：88.