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       【摘要】 
       目的观察3种中药复方体外对白色念珠菌生物膜形成的影响。方法采用结晶紫染色法和MTT 法评价白色念珠菌生物膜的体外生长动力学, 微量稀释法检测3种中药复方对白色念珠菌悬浮菌及其生物膜的抑制作用以及药物包被对白色念珠菌生物膜形成作用。结果生物膜内白色念珠菌数量随培养时间延长而增加。3种中药复方对白色念珠菌悬浮菌的最低抑菌浓度50%(MIC50)分别为3.255,3.565,3.875 mg/ml,对生物膜的SMIC50与SMIC80分别是3.255，6.51，3.565，7.12 mg/ml，3.875，7.623 mg/ml。3种中药复方包被浓度分别在7.882，3.808，6.357 mg/ml以上时对其生物膜形成的抑制作用有显著性。结论3种中药复方对体外白色念珠菌生物膜具有明显的抑制作用。
       【关键词】  中药复方; 白色念珠菌; 生物膜
        近年来，随着广谱抗生素、糖皮质激素、免疫抑制剂等的被广泛使用，白色念珠菌等真菌引起的感染机会显著增多。白色念珠菌等真菌耐药菌株不断出现，针对生物膜相关感染难治性、易复发，现有抗真菌药物较少并具较强毒副作用等问题，必须寻找出更好的药物和方法抗真菌及相关生物膜感染。目前中草药治疗真菌感染有不少报道,曾有文献称对862种中草药(动物药15种,矿物药13种,植物药834种) 进行了抗白色念珠菌的活性筛选,其中有初步活性的103种(11.7%)［1］。但有关中草药对念珠菌生物膜的影响报道较少。本研究从文献、临床收集了对霉菌性阴道炎有较明显作用的中草药复方3种,进行体外抗白色念珠菌生物膜作用的实验［2］,探讨这些中药复方对体外念珠菌生物膜形成的影响, 旨在为解决念珠菌感染性疾病易复发、易产生耐药性提供新的途径。
       1  材料与仪器
       1.1  菌株白色念珠菌标准菌株ATCC10231，购于合肥市疾病控制中心。
       1.2  药物3种中药复方。
        复方1(坐浴剂，安徽中医学院附属第一医院妇科组方):苦参10 g,百部30 g,野菊花30 g,蛇床子50 g,土槿皮30 g,公丁香10 g,黄柏50 g。　
        复方2(灭霉灵擦洗剂)［3］:茜草30 g,黄连20 g,黄柏20 g,苦参20 g,虎杖30  g,蛇床子10 g,艾叶10 g,白鲜皮10 g,土槿皮10 g,丁香9 g,百部30 g,苍术15 g,藿香15  g,黄精20 g,枯矾9 g。
       
       复方3(坐浴剂)［4］:萆薢12 g,薏苡仁15 g,土茯苓30 g,藿香15 g,白矾30 g,薄荷5 g。
        以上3种中药复方均购于安徽中医学院附属第一医院中药房,并经鉴定。每方均经水浸泡30 min后,常规水煎,药物浓度均调至每毫升含1 g生药。
       1.3  培养基RPMI1640培养基(GIBCO公司),YPD培养基依据文献［5］配制。
       1.4  试剂结晶紫( 天津市光复精细化工研究所),四甲基偶氮唑盐(MTT,Sigma 公司),二甲基亚砜(DMSO,上海金山化工厂) 。
       1.5  检测仪器318-酶标仪(上海),96 孔微量培养板(杭州生友生物技术有限公司)。
       2  方法
       2.1  白色念珠菌生长动力学的检测［5，6］将浓度1×106个细胞/ml的菌液100 μl接种于96孔微量培养板中,37℃培养,分别于接种后2，4，6，8，24，48 h,弃去培养基, 用PBS(pH 7.2)洗去未黏附菌。用结晶紫染色法［7］测定白色念珠菌生物量(biomass):将1%结晶紫100 μl加入孔内,37℃孵育20 min,PBS洗3遍,酶标仪490 nm 波长下检测吸光度。
       2.2  3种中药复方对悬浮白色念珠菌MIC的测定 依据NCCLS 的M27-A方案［8］,先按二倍稀释将药物100 μl加到96孔板中,再加入0.5×103～2.5×103/ml菌体的混悬液100 μl,37℃培养48 h,以无菌生长的最小药物稀释度作为各菌株的最低抑菌浓度(MIC) 。
       2.3  3种中药复方对白色念珠菌生物膜MIC( SMIC)的测定［9］将白色念珠菌接种于YPD 培养基中,37℃摇床过夜培养,收集菌体,用RPMI1640培养基稀释,调整菌液浓度为1×106/ml。将100 μl该96 孔板中,37℃培养24 h,使白色念珠菌完全黏附于平底的96孔板基底表面,形成念珠菌生物膜的结构。生物膜形成后,弃去培养基及悬浮菌,用PBS洗3次,将药物按两倍稀释加到各孔中,继续培养48 h。MTT法检测抑制生物膜50%( SMIC50) 及80%( SMIC80) 的药物浓度:即50 μl的MTT 溶液( 贮存液含5 mg/ml PBS,临用前用预温的0.15 M PBS 按1∶5 稀释)加入每孔中, 37℃孵育5 h。弃去含MTT的培养基,PBS洗3遍,加入DMSO100 μl,振荡5 min,在酶标仪490 nm波长下检测吸光度。
       2.4  3种中药复方预处理96孔板［10］用无菌的PBS将五种中药复方分别按二倍连续稀释成7个浓度梯度: 100，50，25，12.5，6.25，3.125，1.56 mg/ml, 200 μl/孔,4℃过夜。吸弃药物,PBS洗1遍,每孔加入100 μl的菌液(1×106 个细胞/ml), 37℃培养24 h。吸出孔内菌液,PBS洗3遍,MTT法(方法同上)检测吸光度。
       2.5  统计学处理实验结果采用SPSS 11.5统计软件检验。实验重复3次,每个药物浓度均设8个复孔,取平均值。
       3  结果
       3.1  白色念珠菌生长曲线结晶紫染色所显示的是白念珠菌生物量［11］。生物膜内念珠菌的数量随培养时间延长而增加,在2～8 h内明显升高。随培养时间不断延长,生物膜细胞数量趋于稳定,24～48 h基本持平。结果见图1。
       3.2  3种中药复方对悬浮白色念珠菌的MIC经检测, 3种中药复方对悬浮白色念珠菌的MIC范围见表1。表1  3种中药复方对悬浮白色念珠菌的MIC（略）
       3.3  3种中药复方对生物膜白色念珠菌MIC(SMIC)经MTT法检测,3种中药复方对白色念珠菌生物膜的SMIC50 和SMIC80 见表2。
       表2  3种中药复方对白色念珠生物膜的SMIC50和SMIC80MICmg·ml-1
       复方SMIC50SMIC80复方13.2556.51复方23.5657.12复方33.8757.623
       3.4  96孔板药物包被对白色念珠菌生物膜的影响
       3.4.1  复方1与阳性对照孔(未加药)相比较,药物浓度在7.882 mg/ml以下时,对白色念珠菌生物膜的抑制作用无显著性差异(P>0.05);药物浓度达到7.882 mg/ml以上时,96孔板药包被对白色念珠菌生物膜形成的抑制作用有显著性(P<0.05)。
       3.4.2  复方2与阳性对照孔(未加药)相比较,药物浓度在3.808 mg/ml以下时,对白色念珠菌生物膜的抑制作用无显著性差异(P>0.05);药物浓度达到3.808 mg/ml以上时,96孔板药包被对白色念珠菌生物膜形成的抑制作用有显著性(P<0.05)。
       3.4.3  复方3与阳性对照孔(未加药)相比较,药物浓度在6.357 mg/ml以下时,对白色念珠菌生物膜的抑制作用无显著性差异(P>0.05);药物浓度达到6.357 mg/ml以上时,96孔板药包被对白色念珠菌生物膜形成的抑制作用有显著性(P<0.05) 。
       4  讨论
        白色念珠菌是一种常见的条件致病菌。该菌容易附着于生物组织与生物材料的表面, 从而形成一种由大量基质将其包裹的生物膜。生物膜内念珠菌比其悬浮菌更加耐药、难治、所致感染易复发［12］。目前应用于临床的抗真菌药物种类有限, 且副作用较大,难以杀死膜内菌,长期使用容易产生耐药性。因此从中药中发掘具有抗真菌和抗生物膜作用的药物成为非常重要的研究方向。本试验采用了祖国传统医学的中药复方,探讨其抗念珠菌生物膜的功效。虽已公认诸药对霉菌性阴道病有治疗作用,但其对生物膜是否具有抑制作用尚未见报道。本试验结果显示,白色念珠菌在96孔微量培养板中生长迅速,24～48 h便可形成稳定的生物膜,尤其以开始2～8h内生长最快。三种中药复方对白色念珠菌悬浮菌具有良好的抑制作用,MIC和SMIC的测定也显示出一定的抵抗作用。S.P.Bachmann等［10］发现,96孔微量培养板孔用卡泊芬净(Caspofungin,棘白菌素类抗真菌新药)预先包被,可获得一定的抗念珠菌生物膜形成功能。本研究中也发现,提前用适当浓度的这3种中药复方包被96孔板,也可抑制念珠菌生物膜的形成,提示生物材料如果预先用药物处理,使药物从其中缓慢释放出来,在与生物膜菌的相互作用过程中会产生一定的抗菌效果,这在预防生物医疗材料相关感染性疾病中具有积极的意义。
        经3组实验可以看出，3种中药复方都对白色念珠菌生物膜有抑制作用，但相比较而言，复方1对白色念珠菌生物膜的抑制作用更加显著；从药物预先包被抗念珠菌生物膜形成方面，复方2效果更为明显。
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