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       【摘要】 
       目的研究单侧输尿管梗阻（UUO）及再通后大鼠尿微量蛋白的变化和抗纤灵对尿微量蛋白变化的影响。方法建立大鼠UUO模型120只和UUO再通模型90只，随机分为正常组、假手术组、模型组、抗纤灵组和科素亚组。于造模后各时间点检测大鼠尿转铁蛋白（TRF）、尿视黄醇结合蛋白（RBP）、尿β2-微球蛋白（β2-M）。结果在UUO模型中，模型组各时间点TRF、RBP、β2-M较正常组和假手术组明显升高（P<0.01），并随梗阻时间的延长逐渐升高。在UUO再通模型中，各时间点TRF、RBP、β2-M较正常组和假手术组明显升高（P<0.01），并随梗阻时间的延长逐渐降低。与模型组比较，抗纤灵能明显降低两模型中TRF、RBP、β2-M。结论抗纤灵冲剂能减少UUO模型和UUO再通模型中的尿微量蛋白尿，改善两种模型中的肾损伤。
       【关键词】  抗纤灵冲剂； 单侧输尿管梗阻； 单侧输尿管梗阻后再通； 尿微量蛋白
       Effects of “Kang Xian Ling Decoction” on Urinary Microprotein in Rats after Unilateral Ureteral Obstruction and Recanalization
       WU Feng, SHEN Liping, ZHANG Xinzhi, HUANG Di, DONG Feixia, HE Liqun
       1. Shuguang Hospital, Shanghai University of TCM, Shanghai 201203, China; 2. Key Laboratory of Liver and Kidney Disease, Ministry of Education, Shanghai, 201203, China; 3. TCM Internal Medicine e-institute of Shanghai University, Shanghai 201203, China; 4. Yangpu Hospital of TCM, Shanghai 200041, China
       Abstract：ObjectiveTo explore the effects of “Kang Xian Ling Decoction” (KXL) on urinary microprotein in rats after unilateral ureteral obstruction and recanalization.Methods120 male Sprague-Dawley rats in UUO model and 90 male Sprague-Dawley rats in UUO recanalization model were randomly divided into 5 groups: Normal group, Shame-operated group, Model group, KXL group, and Lostartan group. Urinary transferrin (TRF), retinol-blinding protein (RBP) and β2-microglobuli (β2-M) were tested weekly. ResultsIn UUO model, the levels of TRF,RBP,β2-M in Model group were increased, compared with Normal group and Shame-operated group, and it had significant difference（P<0.01）. In UUO model, the levels of TRF,RBP,β2-M in Model group were increased  compared with Normal group and Shame-operated group（P<0.01）, but they were decreased. Compared with Model group, TRF,RBP,β2-M contents in KXL group were decreased significantly. ConclusionKang Xian Ling Decoction can decrease urinary microprotein in rats after UUO and UUO recanalization, and improve renal fibrosis.
       Key words：Kang Xian Ling Decoction;  Unilateral ureteral obstruction;  Recanalization after unilateral ureteral obstruction;  Urinary microprotein
       
       尿微量蛋白是指尿中超过正常范围但用常规定性或定量的方法难以检出的一些蛋白质。目前检测尿微量蛋白对肾脏疾病的早期诊断具有重要作用，已被认为是诊断早期肾损害的灵敏指标［1］。尿微量蛋白既是肾小球疾病的标志，也是肾间质纤维化病情发展最重要的独立危险因素［2］。
        
       肾纤维化是几乎所有慢性肾脏病进展导致肾功能损害的共同病理过程，尤其是肾小管间质的纤维化与慢性肾脏病的预后更密切相关。单侧输尿管梗阻（UUO）是研究肾纤维化的经典实验动物模型。UUO能直接导致肾小管间质纤维化（TIF），并且啮齿类动物的肾纤维化的特征与人类相似［3］。在UUO模型的肾纤维化起始和发展过程中，有许多细胞、分子的变化可以被容易地检测定量，这使得UUO越来越成为一个好的实验研究模型［4］。然而，目前对UUO模型的肾损伤研究缺少连续动态的观察，并且UUO后的尿液不能反映梗阻肾的肾损伤。因此，我们创造性的应用UUO再通技术，连续动态的多个时间点观察UUO后以及UUO再通后，非梗阻肾和梗阻肾的尿微量蛋白变化。
       
       抗纤灵冲剂是临床治疗慢性肾衰疗效肯定的经验方。以往的研究应用大鼠5／6肾切除所致肾小球硬化模型，证实抗纤灵不仅能减少24 h尿蛋白定量延缓肾小球硬化进展［5］，而且能改善肾脏纤维化，延缓肾功能的恶化［6］。我们的研究首次应用UUO模型和UUO再通模型，观察两种模型中联合检测尿转铁蛋白（TRF）、尿视黄醇结合蛋白（RBP）、尿β2-微球蛋白（β2-M）的变化和抗纤灵冲剂的作用。
       1  器材与方法
       1.1  试剂与仪器抗纤灵冲剂（组成：丹参30 g，桃仁15 g，全当归15 g，牛膝15 g，制大黄15 g），取自上海市中医药大学附属曙光医院中药房。科素亚（杭州默沙东公司）购自医院药房。尿转铁蛋白（TRF）、尿视黄醇结合蛋白（RBP）、尿β2-微球蛋白（β2-M）测定试剂盒购自南京建成生物工程研究所。M5多功能酶标仪。
       1.2  动物及分组健康雄性SD清洁级大鼠,由上海中医药大学动物实验中心提供并饲养，自由饮食。适应性喂养1周后分组。UUO实验大鼠120只，体质量（206±7）g,随机分为空白组、假手术组、模型组、抗纤灵组和科素亚组各24只。UUO再通实验大鼠90只，体质量（206±6）g，随机分为空白组、假手术组、模型组、抗纤灵组和科素亚组各18只。
       1.3  模型制备
       1.3.1  UUO模型制作方法先以3％戊巴比妥钠（1.5 ml/kg）腹腔注射麻醉，背部左肋脊角处做一纵行切口，游离左肾及输尿管，在输尿管中段两端各用丝线结扎，不剪断输尿管，然后分层缝合。假手术组除不结扎输尿管外，余步骤同上。
       1.3.2  UUO再通模型制作方法先制作UUO模型，方法同上。假手术组除不结扎输尿管外，余步骤相同。1周后行再通术，麻醉方法和手术路径同上，分离原结扎的左侧输尿管并去除结扎，再行右肾结扎。分层缝合。假手术组除不做再通输尿管和结扎右肾外，余步骤同上。
       1.4  给药方法抗纤灵组和科素亚组大鼠从造模后第1天起采用灌胃给药。药物溶液剂量均为成人剂量的10倍，1 ml/d。正常组、假手术组、模型组给予等量生理盐水。
       1.5  观察指标和方法UUO模型各组分别于造模后7，14，21，28 d随机选取6只大鼠置于代谢笼中收集24 h尿。UUO再通模型各组分别于造模后7，14，21 d随机选取6只大鼠置于代谢笼中收集24 h尿。尿标本酶联免疫法检测TRF、RBP、β2-M。检测方法严格按照试剂盒说明书。
       1.6  统计学处理所有计量资料采用±s表示，利用SPSS15.0软件进行统计分析，采用单因素方差分析，应用Levene检验进行方差齐性检验，组间样本两两比较用LSD-t检验，P<0.05为差异有统计学意义。
       2  结果
       2.1  UUO模型中尿微量蛋白尿变化 
       模型组中各时间点的尿TRF、RBP、β2-M与正常组和假手术组比较有显著升高（P<0.01），并随梗阻时间的延长逐渐升高。抗纤灵组与模型组比较，各时间点尿RBP、β2-M、TRF均有明显下降，TRF分别下降了32.2%，46.2%，34.0%，31.9%（P<0.01）；RBP分别下降了17.8%，31.9%，29.3%，26.7%（P<0.05，P<0.01，P<0.01，P<0.01）；β2-M分别下降了25.4%，22.9%，14.4%，13.4%（P<0.01，P<0.01，P<0.05，P<0.05）。抗纤灵组与科素亚组比较，TRF和RBP在14，21，28 d均有明显降低（P<0.01）。结果见表1。表1  UUO模型各组大鼠尿微量蛋白结果（略)
       2.2  UUO再通模型中尿微量蛋白变化模型组中各时间点的尿TRF、RBP、β2-M与正常组和假手术组比较有显著升高（P<0.01），并随解除梗阻时间的延长逐渐降低。抗纤灵组与模型组比较，各时间点尿RBP、β2-M、TRF均有明显下降，TRF分别下降了39.4%，29.5%，23.9%（P<0.01或P<0.05）；RBP分别下降了27.5%，30.8%，30.8%（P<0.01）；β2-M分别下降了13.3%，23.6%，22.5%（P<0.05或P<0.01）。抗纤灵组与科素亚组比较，仅RBP在第7天时有显著差异，其余均无显著差异（P>0.05）。结果见表2。表2  UUO再通模型各组大鼠尿微量蛋白结果（略)
       3  讨论
           
       近年来尿液中的生物标志物的检测引起关注，有学者认为可以替代肾活检术判断疾病的进展、监测治疗反应及判断预后［7］。RBP、β2-M和TRF就是常用的尿液生物标志物。正常情况下，血浆相对分子质量<60 000的蛋白质较容易通过肾小球滤过膜，并几乎被近端肾小管完全吸收和降解，而TRF由于分子质量较大，相对分子质量约为77 000，加之由于膜电荷的选择屏障作用，一般不从肾小球滤过膜滤出。但当肾小球的滤过屏障受损时，尿中的TRF可明显升高。TRF被认为是更早更敏感地反映肾小球滤过膜损伤的标志性蛋白［8］。β2-M属于小分子蛋白，分子量约11 800，在正常血中几乎全部从肾小球滤过，约99.9%被近曲小管重吸收，并在细胞内被溶酶体系统分解。在近曲小管受损和肾小管间质病变时，尿β2-M显著增加。β2-M是经典肾小管标记蛋白，可直接反映肾小管功能［9］。RBP是体内正常存在的小分子蛋白，相对分子质量21 200，血浆中90％以上的RBP与甲状腺素前蛋白结合，形成大分子蛋白复合物，不能从肾小球自由滤过。血清中少量游离的RBP自由通过肾小球滤过膜，滤过的RBP在肾小管几乎被全部重吸收降解。当近端小管受损时，因重吸收功能下降，尿RBP可明显升高。尿RBP稳定性比β2-M 好，检测方法相对简单，RBP作为判断肾近端小管功能受损的指标较β2-M更理想［10］。目前研究认为，对肾脏损伤的检测指标，联合检测的阳性率要高于各指标的单独检测［11］。
        
       抗纤灵冲剂以活血化瘀、扶正降浊为原则组方，药味组成精简，对慢性肾衰临床疗效显著。以往的实验研究证明，在大鼠肾缺血一再灌注模型中，抗纤灵能减轻肾内血流动力学的紊乱，起到改善肾脏损伤和保护肾功能的作用［12］。而UUO和UUO再通后，首先是血流动力学的变化。
        
       我们的研究采用联合检测尿微量蛋白方法应用于UUO和UUO再通模型。结果发现，在UUO模型中，模型组中各时间点的尿TRF、RBP和β2-M与正常组和假手术组相比有显著性升高（P<0.01），并且随梗阻时间的延长而更加明显。提示在UUO后，大鼠梗阻对侧的“健肾”出现了持续性的肾损伤。并且这种损伤随梗阻时间的延长而加剧。“健肾”的肾损伤可能与梗阻后，“健肾”代偿导致肾单位高流量、高压力、高滤过和重吸收增加有关。另外，在UUO再通模型中，模型组中各时间点尿TRF、RBP和β2-M与正常组和假手术组相比同样有显著性升高（P<0.01），并且随着解除梗阻的时间延长而趋于下降。提示在梗阻解除后，原来的梗阻肾仍存在肾损伤，这种损伤在梗阻解除21天时仍存在，但趋向逐步好转。其损伤的原因可能与UUO后肾小管间质的纤维化及UUO再通后血液动力学改变所致的再灌注损伤有关。但是，与UUO模型不同，再通模型中的肾损伤随梗阻时间的延长而逐步好转。这两种相反的趋势是否与UUO后梗阻肾纤维化的逐步加重，而再通后对侧肾完全结扎后导致原来的梗阻肾成为独肾的纤维化逐步好转有关目前还不清楚。
        
       本实验显示，抗纤灵冲剂能明显减少UUO后及UUO再通后的尿微量蛋白，改善UUO后及UUO再通后的肾损伤。在两种模型中，与模型组比较，抗纤灵组能明显减少尿TRF、RBP和β2-M，有统计学意义。在UUO模型中，抗纤灵的疗效要优于目前临床降蛋白尿作用明确的科素亚，尿TRF和RBP在14，21，28 d均有明显降低（P<0.01）。
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