文章标题 全文   多个检索词，请用空格间隔。

       【摘要】 
       目的研究苦参碱诱导人肝癌细胞株HpG2.2.15的凋亡机制。方法使用MTT法测定细胞生长率，流式细胞仪检测细胞凋亡和Fas蛋白的表达，RT-PCR检测Fas基因的表达。结果苦参碱对人肝癌细胞株HpG2.2.15的生长抑制率为75.5%。苦参碱具有诱导HpG2.2.15细胞凋亡的作用，诱导细胞凋亡率为57.9%。苦参碱诱导人肝癌细胞株HpG2.2.15Fas基因的表达率（4.11%）优于对照组DDP（3.7%）。苦参碱可使细胞株的Fas蛋白表达增加。结论苦参碱具有诱导HpG2.2.15细胞凋亡的作用，其作用是促进Fas基因的表达，使Fas蛋白增加。
       【关键词】  HpG2.2.15细胞株； 苦参碱 ； 凋亡； 凋亡蛋白
        乙肝病毒与肝癌发生密切相关，两者相关率高达80％，在肝细胞癌中，血清HBV阳性感染率为94.78％；HBsAg阳性携带率为89.57％［1］。HBV-DNA与肝细胞DNA紧密结合在一起，乙肝病毒产生的X蛋白在肝癌的发生和发展中起着重要的作用。苦参碱可诱导人肝癌细胞株HpG2凋亡，应用全基因组表达谱芯片检测差异表达基因，苦参碱可改变人肝癌细胞株HpG2细胞基因谱，调控凋亡基因的表达，在苦参碱治疗的C6细胞株中，57个基因表达上升2倍，而11个基因至少下调2倍［2，3］。苦参碱可诱导wp53的表达，从而激活Bax基因，抑制Bc1-2基因；并且wp53还可能诱导Fas的表达，最终导致细胞凋亡［4］。苦参碱促进HpG2细胞Bax的表达，抑制Bcl-XL 和Bcl-2蛋白的表达，说明苦参碱可通过抑制HepG2细胞内Bcl-2/Bcl-XL的活性，减少细胞色素C的释放，激活caspase-3蛋白进而激活caspases蛋白酶家族，诱导细胞凋亡的发生［5］。
         　
       HpG2.2.15细胞株是将乙肝病毒X基因转染到HpG2细胞株内所得，更符合中国人乙肝诱发原发性肝癌的发病特点。本实验研究苦参碱对人HpG2.2.15细胞株的作用。
       1  材料
       1.1  细胞株人HpG2.2.15细胞株，由本实验室保存。在含10％胎牛血清的DMEM培养液中，37℃，5％CO2条件下培养。
       1.2  试剂苦参碱注射液5 ml∶50 mg，江苏吴中医药集团有限公司，批号070604。MTT和G418购自sigma 公司，胰蛋白酶和Fas抗体购于sigma 公司。DAB试剂盒购自天津灏洋生物公司，ABC-Kit试剂盒购自sigma公司。兔抗人HBxAg多克隆抗体（HBx99  rabbit  pdycolonal  AB  serum，Rabbit 2）由本实验室保存。
       1.3  仪器酶标仪（美国Bio-Rad公司680）， BD FACSCanto流式细胞仪，电泳仪(美国Bio-Rad公司)，紫外透射仪(美国Bio-Rad公司)。
       2  方法
        分为治疗组、对照组和空白组。对照组采用顺铂。
       2.1  MTT实验法①MTT用PBS配制成5 mg/ml。②细胞悬液以104/孔接种于96孔培养板（200 μl/孔），治疗组每孔加入苦参碱10μl（200 μg/ml），对照组DDP10 μl（20 μg/ml），空白组加入培养液10 μl/孔。③在37℃，5%CO2的培养箱中培养24 h。④每孔加入MTT20 μl，每次3孔，37℃作用4 h。⑤吸弃各孔中的上清，每孔加入DMSO 150 μl，振荡，紫蓝色沉淀充分溶解，用酶标仪在波长540 nm处测定吸光度A值。⑥上述试验重复4次。
       2.2  流式细胞学检测法①对数生长期的细胞，胰酶消化后，以5×104/ml的密度接种，贴壁后加入DMEM培养基培养24 h，治疗组加入苦参碱10 μl（200 μg/ml），对照组加入顺铂10 μl（20 μg/ml），空白组加入等体积的培养液。②继续培养48 h，胰酶消化成单细胞悬液，冰PBS 洗涤2次，800 r/min离心5 min，弃上清，缓慢加入-20℃预冷的70%乙醇，4℃过夜。③取细胞悬液，PBS洗涤，1 600 r/min离心5 min后，弃上清。PI 染液1.0 ml染30 min，混合液经过300目滤网以除去杂质，620 nm 检测。每样本收集多于10 000个荧光信号。④在流式细胞仪上作Fas基因表达分析。将细胞培养后直接将细胞送至流式细胞室做检查。
       2.3  RT-PCR试验方法
       2.3.1  引物序列Fas-F5"-TCCTACCTCTGGTTCTTAC-3"Fas-R5"-CTCTTCACTTCCTCTTTGC-3"Beta-actin F5"- ACTCTTCCAGCCTTCCTT-3" Beta-actin R5"- ACTCGTCATACTCCTGCT-3"
       2.3.2  逆转录过程（RT）试剂：5×AMV buffer   RNA酶抑制剂   随机引物   DNTPs  AMV RT反应体系20 μl灭菌的DEPC水10.3 μl5×AMV buffer4 μlRNA抑制剂0.4 μlOligo(DT) 1 μldNITs1.3 μlRAN2 μlAMV 1 μl
       2.3.3  反应条件37℃90 min，95℃10 min，4℃pause。
       PCR 反应体系25 μl dH2O14 μl10×PCR  Buffer2.5 μldNTPs1.2 μlPrimer11.2 μlPrimer21.2 μlTemplate4 μlTaq 酶0.8 μl
       2.3.4  PCR反应程序95℃4 min → 95℃40 s →  54℃30 s → 72℃30 s →72℃5 min →4℃ pause
       3  结果
       3.1  苦参碱抑制HpG2.2.15 细胞增殖（MTT）的实验结果 细胞生长抑制率的计算公式为：细胞生长抑制率（%）=实验组OD值/ 对照组OD值×100％。以生长抑制率的结果大于50%有效。DDP的细胞生长抑制率86%，苦参碱的细胞生长抑制率为75.5%，低于DDP的抑制率，但是高于50%的有效标准，苦参碱对人肝癌HpG2.2.15细胞株有抑制增殖的作用。结果见图1。
       从图2中可看出，顺铂和苦参碱组的吸光度值随着时间的延长而减少，细胞数量逐渐减少，顺铂和苦参碱具有诱导人肝癌HpG2.2.15细胞株凋亡的作用。
       3.2  细胞凋亡细胞凋亡的实验结果见图3。
        经χ2 检验，χ2=8.00，P= 0.000，按a=0.05水准，各组诱导细胞凋亡有差别。苦参碱诱导细胞凋亡率为57.9%。结果见图4。
       
       3.3  苦参碱对Fas蛋白的影响诱导Fas蛋白的表达。见图5。
       经χ2检验， χ2=1.41，P= 0.000，按a=0.05水准，在诱导Fas基因表达具有统计学意义。苦参碱诱导Fas基因的表达率（4.11%）要优于DDP（3.7%）。见图6。
       3.4  苦参碱对Fas基因的影响Fas表达产物是495bp，HpG2.2.15细胞株Fas基因表达较弱，HpG2有明显Fas基因表达。苦参碱可以诱导HpG2.2.15细胞株的Fas基因表达，其作用要低于内毒素。结果见图7～8。
       4  讨论
        肝细胞凋亡抑制与肝癌以及胆管癌的发生和发展具有密切的关系，在肝纤维化中也具有重要的作用［6］。诱导肿瘤细胞凋亡和正常分化是恶性肿瘤治疗的主要目标，Fas/FasL是细胞凋亡的主要机制。
        通过MTT实验，苦参碱可以显著减少细胞生长的数量，虽没有顺铂组抑制率高，但是也超过有效的标准。细胞抑制率与苦参碱的浓度密切相关，浓度越高，抑制率越显著。在流式细胞仪测定细胞凋亡的实验中，可以看到苦参碱有显著的凋亡峰值，随着时间延长，细胞凋亡数量明显增加，而细胞凋亡主要阻滞于G1期。这说明苦参碱具有诱导人肝癌HpG2.2.15细胞株凋亡的作用。
        细胞凋亡主要与Fas基因的表达密切相关，用流式细胞仪测定Fas蛋白的表达，可以看到Fas蛋白表达的数量与时间密切相关，随着时间延长，表达Fas蛋白的细胞数量增加，苦参碱诱导Fas蛋白表达的数量要高于顺铂。使用RT-PCR的方法检测Fas基因，苦参碱有促进Fas基因表达的作用。苦参碱具有诱导HpG2.2.15细胞的Fas基因表达，使Fas蛋白增加，从而诱导细胞凋亡。
        研究表明，苦参碱有抑制胃溃疡形成的作用，可减少胃酸的分泌［7］，具有抑制肝细胞的PDGF 和TGF-beta1的活性，从而具有抗肝纤维化的作用［8］，可通过减少血管兴奋蛋白磷酸化而抑制PKA的活性，从而减少Hela细胞的黏附和转移［9］，具有抑制K-562细胞株增殖和诱导分化的作用，64.6%细胞阻滞在G1期［10］。苦参碱具有抗恶液质的作用，可能是抑制了白细胞介素-6和TNF-a的作用［11］。HBx蛋白可使乙肝病毒的复制加快［12］，使肝癌细胞对细胞毒药物的具有抵抗性。
       
       研究表明，苦参碱具有诱导人肝癌HpG2.2.15细胞株凋亡的作用，其作用机制是促进Fas基因的表达，使Fas蛋白增加。
       【参考文献】
         　　［1］阮秀花，田 葱，张效本，等.肝癌患者乙型肝炎病毒感染血清流行病学分析［J］.现代中西医结合杂志，2007，16（14）：2031.
       
       ［2］Zhang S, Qi J, Sun L，et al. Matrine induces programmed cell death and regulates expression of relevant genes based on PCR array analysis in C6 glioma cells［J］. Mol Biol Rep，2008,8(4) :341.
       
       ［3］薛 净，李瑜羌，聂玉强，等. 苦参碱对人肝癌细胞株HepG2基因表达谱的影响［J］.胃肠病学和肝病学杂志，2007,16(4):341.
       
       ［4］司维柯，陈 安，李 鹏，等.苦参碱诱导人肝癌细胞株HepG2 凋亡的研究［J］.第三军医大学学报，2001,23(7): 816.
       
       ［5］侯 颖，曹 蔚，李涛等. 氧化苦参碱诱导人肝癌HepG2细胞凋亡的可能机制［J］.第二军医大学学，2008,29(6): 634.
       
       ［6］Me Guicciardi， G J Gores. Apoptosis: A me Chanism of Acute and CHR［J］. Onic Liver injury Gut ，2005，54:1024.
       
       ［7］Yamazaki M. The pharmacological studies on matrine and oxymatrine［J］.Yakugaku Zasshi，2000，120(10):1025.
       
       ［8］Zhang JP，Zhang M， Zhou JP,et al. Antifibrotic effects of matrine on in vitro and in vivo models of liver fibrosis in rats［J］.Acta Pharmacol Sin， 2001 ，22(2):183.
       
       ［9］Zhang L， Wang T，Wen X ，et al. Effect of matrine on HeLa cell adhesion and migration［J］. Eur J Pharmacol，2007,563(1-3):69.
       
       ［10］Zhang LP，Jiang JK，Tam JW,et al. Effects of Matrine on proliferation and differentiation in K-562 cells［J］. Leuk Res，2001，25(9):793.
       
       ［11］Zhang Y，Wang S， Li Y ，et al. Sophocarpine and matrine inhibit the production of TNF-alpha and IL-6 in murine macrophages and prevent cachexia-related symptoms induced by colon26 adenocarcinoma in mice. Int Immunopharmacol［J］.2008，8(13-14):1767.
       
       ［12］Victor V. Keasler, Amanda J. Hodgson, Charles R etal. Enhancement of Hepatitis B Virus Replication by the Regulatory X Protein In Vitro and In Vivo［J］.Journal Of Virology，2007，81(6) ：2656.