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       【摘要】 
       目的应用原子力显微镜（AFM）观察苦参提取物（RSF）在低于临界溶血浓度时对红细胞表面形貌的影响，并探讨其相关机理。方法红细胞悬液与 0.5，2 g·L-1 剂量 RSF 作用后，应用 AFM 观察红细胞形貌，测定细胞内 Ca2+ 浓度及膜 Ca2+-Mg2+-ATPase 活性。结果AFM 形貌图显示 RSF 作用使红细胞凹陷加深；超微结构观察显示 RSF 引起红细胞膜表面凹凸增强及颗粒聚集；同时，红细胞内 Ca2+ 浓度升高，Ca2+-Mg2+-ATPase 活性降低。结论RSF 中苦参碱类化合物与细胞膜中磷脂作用引起膜透性改变及膜表面蛋白质聚集，改变红细胞内骨架结构，引起红细胞表面形貌的改变，该变化与胞内 Ca2+ 浓度升高及膜 Ca2+-Mg2+-ATPase 活性降低相关。
       【关键词】  AFM； 红细胞； 苦参提取物； 钙离子浓度； Ca2+-Mg2+-ATPase
       随着中药研究的深入，现代仪器及技术逐步应用到中药研究领域，拓展了中药基础研究的范围，加深了中药药理作用机理的探讨。近年来，一些生物学家把利用原子力显微镜（AFM）对生物大分子直接观察的技术引入中药研究领域，与扫描电镜相比, AFM 无需复杂制片过程及严格的真空观察条件，具有纳米水平分辨率，能够实现对活细胞表面超精细结构三维数据分析，这些优点使 AFM 成为研究物质表面形貌的重要仪器。特别在探讨中药提取物等外源性物质对红细胞膜结构性能影响方面，AFM 观测成为一种精细而直观的观察手段［1～5］。
       
       苦参Radix Sophorae Flavescentis为药用豆科植物苦参的干燥根，主要化学成分及药理活性成分为生物碱类和黄酮类［6］。其药理活性以抗炎抑菌、抗病毒、抗肿瘤为主，临床上广泛用于治疗慢性肝炎、肝损伤、溃疡、心率失常、黄疸、痈肿、发热等病症，其生物碱类提取物也用于杀虫剂［7,8］。苦参提取物的药理作用及有效成分提取已经有了较为深入的研究，但该提取物对红细胞表面形貌的影响、量效关系及相关机理还有待于进一步深入探索。本文应用 AFM 观察苦参提取物（RSF）在低于临界溶血浓度下作用引起红细胞形貌变化，并对 RSF 引起红细胞内的游离钙浓度变化及对 Ca2+-Mg2+-ATPase 活性的影响进行了较为深入的探讨。
       1  仪器与材料
       1.1  仪器BerMad 2000 原子力显微镜（西班牙），JASCO V-550 UV-vis 分光光度计（日本） JASCO FP 6500型荧光分光光度计（日本）。
       1.2  试药新鲜人抗凝血由长春市中心血站提供，肝素购于华美公司，钙荧光探针Flou-3-AM为美国分子探针公司产品，DMSO为美国sigma 产品，Ca2+-Mg2+-ATPase 测试试剂盒购于南京建成生物工程公司，苦参水提取物（RSF）由吉林省中医中药科学院中药研究所提供。
       2  方法
       2.1  试剂配制及样品处理RSF用PBE缓冲液 (Na2HPO4/NaH2PO4, 10 mmol·L-1, EDTA 1 mmol·L-1, pH=7.4) 溶解至终浓度10 g·L-1，超声处理30 min，16000 r/min 离心，上清液用于实验。Fluo-3-AM溶于DMSO配成浓度为1 g·L-1储备液，-20℃保存，使用浓度为5 μmol·L-1。平衡盐溶液HBS：NaCl, 123 mmol·L-1；CaCl2, 1 mmol·L-1 KCl, 5 mmol·L-1；MgCl2, 1 mmol·L-1；Glucose, 10 mmol·L-1；Hepes, 25 mmol·L-1, pH 7.4。无钙平衡盐溶液：NaCl, 125 mmol·L-1；KCl, 5 mmol·L-1； MgCl2, 1 mmol·L-1；Glucose, 10 mmol·L-1；Hepes, 25 mmol·L-1, pH 7.4。红细胞悬液： 取抗凝血，离心收集红细胞，用 HBS 缓冲液清洗 2 次，2 000 r/min 离心 5 min，弃上清液，沉积的红细胞用 HBS 稀释至 2～4 倍体积，4℃ 保存，用前洗涤，以 HBS 缓冲液配制成 4% (V∶V) 的红细胞悬液。
       2.2  RSF对红细胞溶血率的测定取红细胞悬液，按等体积加入已处理RSF至终浓度为5，10，15，20 g·L-1，参比采用同体积HBS缓冲液代替红细胞悬液。37℃ 温育2 h，期间保持混合充分，离心，测定上清液540 nm处吸光度A。完全溶血红细胞悬液按文献［9］方法制备，以完全溶血吸光度值为A100%，未加药物样品吸光度值为A0，相对溶血率大于 5 % 为溶血，红细胞相对溶血率计算公式如下：相对溶血率 = (A-A0) / (A100%-A0) ×100%。
       2.3  AFM 样品制备及测定取红细胞悬液，根据溶血反应实验结果选择RSF终浓度2，0.5，0.1 g·L-1为作用浓度，于37℃ 共温育0.5 h，温育期间保持混合充分。离心，弃上清，用无钙HBS 缓冲液洗涤红细胞2次，并重悬于无钙HBS 缓冲液中，移取 5 μl悬液滴于干净盖玻片表面，滴加 2.5 %(V∶V) 戊二醛溶液5 μl固定 5 min。多余溶液用滤纸从玻片边缘小心吸去，去离子水洗涤 3 次，空气中自然风干，应用 AFM 对样品进行扫描成像。实验采用 180 μm 扫描器，力常数为 42 N·m-1，频率 250 ～300 kHz，OMCL-AC160TS-W 硅探针，轻敲模式 (tapping mode)；用仪器自带软件采集和处理图像数据，所有图像只经过平滑处理。
       2.4  红细胞内钙离子浓度测定红细胞与 RSF 作用方式同“2.3”项收集细胞，重悬于含5 μmol·L-1 Fluo-3-AM 的无钙 HBS 液中，37℃ 避光孵育 45 min，用无钙 HBS 液洗涤2次，除去游离的 Fluo-3-AM。重悬于原体积无钙 HBS 液中，立即测定不同浓度药物处理后红细胞荧光强度变化，激发波长 490 nm，发射波长 526 nm，狭缝 5 nm，检测过程中温度为 25℃。记录荧光强度值，用以下公式计算红细胞内游离钙浓度：
        ［Ca2+］i=kd·［F-Fmin］［Fmax-F］
       
       其中，Fmin 和 Fmax 最小和最大荧光强度，按照文献［10］方法测得，F为样品荧光强度。其中kd为 Fluo-3 与 Ca2+ 解离常数，25℃ 时kd = 450 nmol/L。
       2.5  红细胞膜表面Ca2+- Mg2+- ATPase 活性的测定红细胞与 RSF 作用及洗涤方法同“2.3”项，离心收集红细胞，蒸馏水破膜 1 h，3000 r/min 离心收集，洗涤 2 次，弃上清液，将沉淀的红细胞膜用一定体积预冰生理盐水悬浮，冰浴保存，按试剂盒说明书方法测定 Ca2+- Mg2+- ATPase 活性。每剂量组测定 3 个平行数据，统计采用单因素方差分析，以P<0.05为差异显著。
       3  结果
       3.1  RSF 的溶血作用实验结果显示，RSF 作用剂量为 5，10，15，20 g·L-1 时，其相对溶血率分别为0.0%，5.69%，9.87%，19.98%，初步确定 RSF 的临界溶血浓度为 5 g·L-1。为避免中药溶液色泽对测定结果的干扰，试验中采用相同浓度的药物溶液作为参比。
       3.2  RSF 对红细胞影响的 AFM 观察应用 AFM 观测了正常红细胞及与 RSF 温育后红细胞样品的整体形态 (7.2 μm ×7.2 μm) 及细胞膜局部精细结构 (600 nm ×600 nm)。正常红细胞样品 AFM 观察结果见图 1，图 1 a 为完整细胞形貌图，图 1 b 为该细胞的直径及高度曲线图。从图中可以看出，红细胞的整体轮廓呈中心凹陷的扁圆盘形状，表面比较光滑。高度约1.0 μm，直径约 6.5 μm，凹陷深度 0.30 μm 左右。
        图1c 是在纳米范围内对正常红细胞膜表面局部区域成像，图中显示细胞膜表面是由大小不同的颗粒状物质密集排列的凹凸表面，颗粒为球形或椭球形，颗粒之间有凹陷，颗粒整齐，没有很高的突起和很深的凹陷；颗粒在整个膜表面均匀分布。凸出的颗粒状物质直径小于 30 nm，表面起伏小于 30 nm，与已有文献报道吻合［1］，颗粒状物质对应膜外周蛋白，凹陷区域对应于细胞膜脂质区。
       
       图2 为红细胞与 0.5 g·L-1 和 2 g·L-1 浓度 RSF 分别作用30 min 后的 AFM 成像，图 2a、2d 为细胞形貌图，图 2b、2e 是相应的直径高度曲线图。与 RSF 作用后，形貌图和高度曲线显示细胞中央凹陷比对照组明显加深并加大，红细胞高度略有增加。不过，2 g·L-1 RSF 作用后细胞中央凹陷更深，细胞表面不平滑，表面界线略显模糊，细胞整体形状有轻微改变。说明药物浓度增加引起了细胞表面进一步改变。以上结果说明 RSF 虽未引起细胞膜表面破裂，但引起红细胞表面形貌变化，中部凹陷加深，表面光滑度降低。
        图 2c、2f 为红细胞膜表面局部区域精细结构图。结果显示，苦参处理后红细胞膜表面颗粒增大，凹凸增强，均匀度降低。虽然膜表面颗粒状物质排列的结构特征依然存在，但颗粒状物质比对照组明显增大，多数在 50～100 nm 之间。图 2f 显示一个较深的“孔洞”，进一步表明随着药物浓度增高，细胞表面起伏增大，平整度差，排列紊乱。总之，AFM 结果显示当苦参浓度低于其临界溶血浓度时，红细胞膜结构及基本形态已经有了改变。实验中 0.1 g·L-1 RSF 剂量组与对照组的形貌基本相似，说明该剂量对红细胞形貌无明显影响。
       3.3  RSF 对红细胞内钙离子浓度的影响以与 AFM 实验中完全一致方法处理红细胞，以 Fluo-3-AM 为荧光探针测定胞浆 Ca2+ 浓度（见表 1）。表1的结果显示，经 0.5，2 g·L-1 浓度的 RSF 处理后红细胞胞浆 Ca2+ 浓度与对照组比较明显增加，呈现明显量效关系。0.1 g·L-1 浓度的 RSF 处理后无明显变化，这与 AFM 观察红细胞膜形貌变化的结果相吻合。表1  RSF 作用后与正常红细胞胞浆 Ca2+ 水平比较（略）
       3.4  RSF 对红细胞膜 Ca2+-Mg2+-ATPase活性的影响
       图 3 给出与终浓度为0.1，0.5，2 g·L-1的RSF作用后，红细胞膜Ca2+-Mg2+-ATPase活性差异的变化，当RSF浓度为 0.5，2 g·L-1时，红细胞膜Ca2+-Mg2+-ATPase活性显著降低，呈量效关系。而红细胞经0.1 g·L-1 浓度的 RSF 处理后，膜Ca2+-Mg2+-ATPase活性反而有所升高。
       4  讨论
        RSF 中主要含有生物碱类和黄酮类化合物，生理条件下，生物碱类物质带正电荷，与细胞膜中带负电荷的磷脂结合，在一定浓度下引起细胞膜结构变化，超过一定限度，即导致红细胞膜破裂血红素释放到细胞外，引起溶血反应。血红素在 546 nm 波长处有最大吸收，采用分光光度法测定中药相对溶血率可以消除常规中药试管观察法所带来的主观误差。我们推测在浓度较低而未引起细胞膜破裂之前，RSF 已经使细胞结构和表面形貌已经发生细微变化。为进一步探讨和验证，通过测定引起溶血的临界浓度，选择一个低于溶血临界浓度的 RSF 浓度与红细胞作用，然后应用 AFM 观察其对红细胞膜表面影响。
       
       红细胞膜由整齐有序的磷脂分子双分子层骨架及膜表面附着外周蛋白构成，外界因素影响使其整齐有序性受到破坏，影响其正常功能［11,12］。试验中 AFM 的观察结果显示，RSF作用后，红细胞表面尽管颗粒状排列特征依然存在，但表面凹陷加深，颗粒增大，蛋白质在膜上排列紊乱；这由于 RSF 与蛋白分子及磷脂分子结合使疏水键受到破坏，诱导膜表面蛋白分子发生聚集和连结，形成较大聚集体，同时引起膜透性的改变，该结果与文献报道类似［13］。
        Ca2+在细胞膜稳定方面起重要作用，胞内游离钙浓度增加可能会造成膜上大分子相互作用改变，细胞内 Ca2+ 积聚过多导致细胞膜变得僵硬，甚至改变膜骨架系统以至于影响红细胞形状及流动性，胞浆Ca2+ 浓度升高也会引起细胞膜脂质重新分布，使膜稳定性下降，因此更容易受到外源物质的影响而引起细胞表面形貌的改变。多种细胞损伤过程中均可观察到胞浆Ca2+ 浓度升高［14～16］。本实验的结果显示 0.5，2 g·L-1 RSF 对细胞内钙的含量有较大影响，其对应的浓度与AFM引起红细胞膜表面结构发生改变的结果相一致，初步认为细胞表面形貌变化与 RSF 引起细胞内钙离子浓度变化有一定关系，即由于RSF 引起膜透性改变导致Ca2+ 浓度升高，损伤了用于维持红细胞形态的骨架系统，导致变形能力降低。与已有文献阐述相一致，即：胞浆Ca2+浓度略有升高则作用于膜骨架而导致红细胞变形能力降低［17］。
       
       胞浆内游离 Ca2+ 浓度比细胞外及细胞“钙库”内低 3～4 个数量级，轻度变化即引起细胞功能的异常。胞内游离 Ca2+ 浓度处于极为严格的调控之中，该调控主要依靠细胞膜 Ca2+-Mg2+-ATPase 来完成，将过多的 Ca2+ 排出细胞或贮存于细胞内钙库中，因此，该酶活性对于维持细胞内 Ca2+ 水平及细胞功能起重要作用［18］。实验结果显示，高浓度的 RSF 作用引起 Ca2+-Mg2+-ATPase 的活性降低，进入细胞内的 Ca2+ 超过钙泵的排出能力，细胞内的 Ca2+ 积聚过多，直接或间接引起其它细胞功能的变化，使膜变得僵硬，影响细胞的骨架系统，并使红细胞形态改变，从而使细胞功能进一步失调。而对于 0.1 g·L-1 RSF 处理组，虽然可能引起细胞内的 Ca2+ 浓度升高，但由于未超过一定限度，Ca2+ 浓度升高反而使 Ca2+-Mg2+-ATPase 的活性代偿性升高，以维持 Ca2+ 处于稳定水平。故在实验结果中，0.1 g·L-1 RSF 剂量组酶活性呈现出不降反升的趋势。这与我们在 AFM 观察中得到的结果及 Ca2+ 浓度测定结果是一致的。综上，细胞内 Ca2+ 浓度的升高是细胞表面形貌变化的重要原因之一，而胞内 Ca2+ 浓度的升高可能缘于细胞膜 Ca2+-Mg2+-ATPase 活性降低。
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