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       【摘要】 
       目的用流动注射化学发光法研究中药金钱草的抗氧化性能。方法将中药金钱草提取物加入三种化学发光体系，测量其发光强度，根据系统化学发光被抑制的程度评价金钱草对活性氧的清除能力，并以抗坏血酸为阳性对照。结果金钱草提取液对O2-·、·OH 、H2O2 三种自由基有较好的清除作用，且清除作用随浓度的增加而增加；对三种自由基的清除能力：H2O2>·OH> O2-·。结论中药金钱草可作为潜在的具有抗氧化活性的天然药物。
       【关键词】  流动注射化学发光； 金钱草提取液； 抗氧化活性
          金钱草为报春花科(Primulaceae)珍珠菜属(Lysimachia)植物过路黄Lysimachia christinae Hance的新鲜或干燥全草，味淡性微寒，有清热、利胆、排石、利尿、解毒的功能。其化学成分主要为黄酮苷类［1］，据报道黄酮类物质对活性氧自由基具有一定的抑制作用［2］；目前，常用的抗自由基活性检测方法主要有：电子自旋共振法［3］、荧光光谱法，分光光度法［4］等，这些方法存在操作复杂、仪器昂贵、检测方法缺乏专一性或灵敏度低等缺点，而化学发光法具有灵敏、快速、操作简单、重现性好等优点，因而，被用于抗自由基活性药物的研究和筛选。目前尚未见用流动注射化学发光法测定中药金钱草抗自由基活性的报道，本文采用邻苯三酚-鲁米诺(Luminol)-碳酸盐缓冲液，亚铁氰化钾-鲁米诺-H2O2 ，H2O2-鲁米诺-碳酸盐缓冲液3个产生自由基的体系，对金钱草提取液与维生素C溶液对比研究其清除O2-·，·OH，H2O2自由基的能力，希望为合理开发该药提供参考。
       1  材料与仪器
        邻苯三酚溶液用1 mmol·L-1的HCl溶液配制，使用前用二次蒸馏水稀释至所需浓度，鲁米诺用0.1 mol·L-1的NaHCO3-Na2CO3缓冲溶液配制成所需浓度；亚铁氰化钾、鲁米诺以及H2O2均用KH2PO4-NaOH(pH=7.20)缓冲溶液配制，使用前配制；所用试剂均为分析纯；实验用水均为二次蒸馏水。
       
       IFFM-D型流动注射化学发光分析仪西安瑞迈科技有限公司。
       2  方法
       2.1  样品溶液的制备样品溶液的制备参照文献［5］方法进行。取5 g金钱草粗粉，加8倍量75%乙醇，超声提取3次，每次45 min，合并提取液，滤过，用石油醚萃取，分离，浓缩，用蒸馏水洗入100 ml量瓶，定容，得金钱草样品含量为1.25 mg·ml-1。
       2.2  流动注射化学发光法仪器条件实验中仪器条件为：延迟时间20 s，测量时间15 s，增益1，滤波器截止频率50 Hz，采样速度20次·s-1，自动调零(NO)，主、副泵速度和负高压依体系而定。
       2.3  流动注射化学发光按图1设计的流动注射化学发光分析流路，蠕动泵分别泵入邻苯三酚溶液、鲁米诺-碳酸盐缓冲液和H2O（·OH体系中，蠕动泵分别泵入鲁米诺、亚铁氰化钾溶液以及H2O2溶液；H2O2自由基体系中分别泵入H2O2、鲁米诺-碳酸盐缓冲液和H2O），分别在混合器中混合并发生反应,记录发光信号。当蠕泵中进的是空白溶液时，发光信号为空白值I0，当进的是待测液或维生素C溶液时，发光信号记为IT，根据发光信号的降低值(I0- IT)，可以定量分析金钱草提取液与维生素C清除自由基的能力。自由基抑制率为：
       
       ［(I0-IT)/I0］×100%
       
        以发光抑制率为纵坐标，样品浓度为横坐标，绘出发光抑制曲线并算出自由基抑制率为50%时的浓度IC50，用来衡量样品对自由基的清除能力。IC50值越小，表明样品清除自由基能力越强。
       2.4  O2-·清除能力检测邻苯三酚在碱性条件下自氧化产生超氧阴离子自由基O2-·，O2-·与化学发光增效剂Luminol反应，使之氧化，产生一个电子激发态的中间物，当其返回基态时，可发出化学冷光，用发光检测装置即可测定发光强度。反应体系中O2-·的量可以用化学发光强度来相对表示。
       
       实验中选择邻苯三酚：0.5 mmol·L-1 ；鲁米诺：7 mmol·L-1；NaHCO3-Na2CO3缓冲溶液pH：10.28，此时体系的发光强度、稳定性及重复性较好。
       2.5  ·OH清除能力检测·OH由Fe2+催化的Fenton体系产生，鲁米诺为发光增效剂。根据反应物和鲁米诺的浓度对化学发光强度、稳定性以及重复性的影响，本实验选择亚铁氰化钾：4 mg·ml-1；鲁米诺：0.35 mg·ml-1；H2O2含量：1.8%。
       2.6  H2O2清除能力检测碱性条件下，过氧化氢氧化鲁米诺使之发光，其发光强度与过氧化氢含量成正比，发光强度的下降可以体现样品清除过氧化氢的能力。实验中H2O2含量：0.48%；鲁米诺：0.15 mg·ml-1；NaHCO3-Na2CO3缓冲溶液pH：9.9。
       3  结果
       3.1  对O2-·的清除作用根据上述条件，分别对其空白溶液、金钱草提取液及Vc溶液进行化学发光强度测定，每个体系重复测定9次，发光强度取平均值进行计算。结果见图2。
       
       由图2可知，金钱草提取液对O2-·自由基有清除作用，且在实验范围内呈明显的量效关系。在低浓度范围内金钱草提取液对O2-·的清除作用低于同浓度的Vc，当二者浓度增大到约为90.06 mg·L-1时，对O2-·的清除效果相当，清除率约为62%，二者浓度继续增加，金钱草提取液对O2-·的清除作用则高于同浓度的Vc；金钱草提取液及Vc对O2-·半抑制浓度（IC50）约分别为61.01和42.03 mg·L-1。
       3.2  对·OH的清除作用由图3可知，在实验范围内金钱草提取液及Vc对·OH的清除率均随浓度增大而增大。将金钱草提取液与Vc对·OH的清除能力进行对比发现在低浓度范围内，同浓度下前者低于后者，当二者浓度增大到约为17.30 mg·L-1时，对·OH的清除效果相当，清除率约为55%，二者浓度继续增加，同浓度下前者则高于后者；金钱草提取液及Vc的半抑制浓度（IC50）约分别为16.05和12.42 mg·L-1。
       3.3  对H2O2的清除作用由图4可知，金钱草提取液及Vc对H2O2的清除能力均随浓度增大而增大。相同条件下，金钱草提取液对H2O2的清除能力低于Vc，半抑制浓度（IC50）约分别为2.46和0.34 mg·L-1。
       
       本实验结果表明，金钱草提取液具有较强的清除自由基的作用。对3种自由基的清除能力依次为H2O2>·OH> O-2·，IC50分别为2.46，16.05，61.01 mg·L-1。
       4  讨论
        主副泵的泵速大小对发光强度有很大影响，实验中3个发光体系主副泵的泵速分别为40和40 r·min-1，40和30 r·min-1，30和20 r·min-1，此时具有较高的发光强度和稳定性。
       
       负高压的大小将直接影响化学发光强度的大小和灵敏度，在其他条件不变的情况下，负高压增大，发光强度增大，同时灵敏度也随之增大，使得发光不稳定。因此，应当根据溶液的配制情况来选择合适的负高压，使得发光强度较大而且稳定，本实验3个体系负高压分别为600，400，500 V。
       
       本研究采用流动注射化学发光法利用金钱草提取液对3种发光体系的抑制作用来测定其抗自由基活性，取得了满意的结果。本方法灵敏度高、快速测定、操作简单和重现性好，可用于评价物质的抗氧化活性及抗自由基活性药物的研究和筛选。
        O2-·、·OH 、H2O2均属于活性氧自由基，具有高度的反应活性，产生某些毒效应。因而维持体内一定浓度水平的抗氧化剂，可以延长寿命和推迟衰老。外加一些抗氧化剂协助体内维持氧代谢的平衡，对于防止疾病的发生和保持机体的健康是十分有益的。本实验结果可知中药金钱草可作为潜在的具有抗自由基活性的药物或保健品。因此本研究为中药金钱草的开发和应用提供了理论基础。
       【参考文献】
         　　［1］王宇杰，孙启时.金钱草的化学成分研究［J］.中国药物化学杂志，2005，15(6):357.
       
       ［2］郑建仙.功能性食品(第2卷)［M］.北京:中国轻工业出版社，1999:765.
       
       ［3］成喜雨，崔 馨，刘春朝，等. 中草药抗氧化活性研究进展［J］. 天然产物研究与开发， 2006，18(10): 514.
       
       ［4］蒋伟哲，孔晓龙，段小群，等. 龙眼参对机体氧自由基清除作用的研究［J］. 中国药房，2001,12(8):453.
       
       ［5］冯丽华，江 丰，袁飞峰. 金钱草总黄酮的超声提取工艺研究［J］. 江西医学院学报，2005，45(6): 60.