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       【摘要】 
       目的利用微波法提取芦根多糖，测定其含量，并研究芦根多糖的抗氧化活性。方法通过正交实验探讨芦根多糖提取的最佳工艺，从清除抑制羟基自由基的产生、还原力和对脂质体抗氧化活性的测定3个方面研究了芦根多糖的体外抗氧化效果, 并同VC 进行比较。结果芦根多糖含量为0.798％。微波法提取芦根多糖的最佳工艺参数为料水比1∶3，微波强度为大火，提取时间8 min。多糖还原能力仅稍次于抗坏血酸；多糖对羟自由基的清除能力较抗坏血酸来说较弱；对脂质过氧化的抑制作用在吸光度小于等于0.88时与多糖的浓度成正相关。结论微波法对芦根中的多糖的提取有辅助作用，芦根多糖具有一定的抗氧化活性。
       【关键词】  微波辅助提取； 芦根多糖； 提取工艺； 抗氧化
       Study on Extraction and Anti-oxidation of Polysaccharides from Reed Rhizome
       SHEN Wei, REN Xiaoting, ZHANG Jian, YANG Jingya
       
       (Food College of Shanghai Ocean University，Shanghai ,201306， China)
       Abstract：ObjectiveTo study the antioxidant activity of Reed rhizome . MethodsThe prepration，purification and determination of polysaccharides in Reed rhizome were investigated．The optimal technical parameters of extracting polysaccharides from Reed rhizome were determined through orthogonal test．The antioxidative activity of Reed rhizome Polysaccharides were studied and compared with Vc including the experiment of inhibiting the formation of hydroxyl radical，reducing power and inhibiting formation of lipid peroxidation.ResultsThe result showed that the optimal technical parameters were liquid—solid ratio l：3 and the extracting time 8minutes under max power through microwave assistant extraction．The concentration of polysaccharide in Reed rhizome was 0.798％．Polysaccharides had obvious reducing capauty and was equal to Vc. Scavenging capability to hydroxyl radical of Polysaccharides was lower than Vc.When Abs was lower than 0.88,the inhibition to lipid peroxidation was equal to polysaccharide.ConclusionMicrowave method is helpful to extract the polysaccharides in the Reed rhizome, and it demonstrates the antioxidant activity of  the polysaccharides.
       Key words：Microwave assistant extraction；  Polysaccharides in Reed rhizome；  Extraction technology；  Anti-oxidation
       
       芦根是一种常用中药。据医书记载, 芦根性味甘、寒入肺、胃经。具有清热、生津、除烦、止呕、利尿等功效, 中医学称之为“火药”。现代药理分析，芦根含有薏苡素、天门冬酰胺等。它的药用价值除退热外, 还具有多种作用。芦根是一味具有多种功能的食材和中药材，它不仅在食用上具有多种搭配，而且在中医药学应用研究方面具有巨大的贡献［1］。
        
       芦根别名芦茅根、苇根、芦柴根、芦菇根、顺江龙、水蓈蔃、芦通、苇子根、芦芽根、甜梗子，有清热生津、除烦、止呕、利尿的功能，主治热病烦渴、胃热呕吐、肺热咳嗽、肺痈吐脓、热淋涩痛。其来源为禾本科植物芦苇Phragmites communis Trin.的新鲜或干燥根茎。鲜芦根呈长圆柱形，有的略扁，长短不一，直径1～2 cm。表面黄白色，有光泽，外皮疏松可剥离，节呈环状，有残根及芽痕。体轻，质韧，不易折断。切断面黄白色，中空，壁厚1～2 mm，有小孔排列成环。无臭，味甘。干芦根呈扁圆柱形，节处较硬，节间有纵皱纹。芦根多糖的使用还未被重视。迄今有关芦根多糖的微波提取尚未见报道，笔者在前期实验的基础上对芦根多糖进行了提取和含量测定研究，以期为芦根的开发利用提供理论依据，并在此基础上对提取的芦根多糖进行体外抗氧化的研究。
       1  仪器与材料
       1.1  仪器721紫外分光光度计，电子天平，旋转蒸发器，烘箱，美的WP700IP17微波炉(功率700 W)，循环水式真空泵，数显恒温水浴锅，电热套，冷凝管。
       1.2  材料新鲜芦根，挖掘自上海南汇芦潮港，经鉴定洗净切碎待用。
       1.3  试剂苯酚(AR),浓硫酸(AR)、无水乙醇、氧仿、正丁醇、葡萄糖、95%乙醇、丙酮、乙醚(均为化学纯)。
       2  方法与结果
       2.1  标准曲线的绘制精密称取充分干燥制恒重的10 mg葡萄糖标准品，加去离子水溶解，配制100 ml标准溶液，标准溶液浓度为0.1 g/L。分别吸取配制好的葡萄糖标准溶液0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，1.2，1.4 ml，分别加去离子水至2 ml,加入5%的苯酚溶液1 ml,摇匀后迅速加入5 ml浓硫酸显色，振荡5 min，在沸水浴上加热15 min,取出后于冷水浴中冷却30 min。以空白为参比，用紫外分光光度计在490 nm处测吸光度［2］。以吸光度(A)对葡萄糖浓度(C)做回归处理，得回归方程：A=9.883 3 C-0.018 7，相关系数r=0.997 3（n=7）。
       2.2  提取芦根多糖的工艺流程 
       称取适量芦根，按一定的料水比(即芦根质量与水的质量比)，调整料水比、提取温度、提取时间，进行热水浸提、抽滤, 滤液进行减压浓缩后, 搅拌下加入950 ml/L 乙醇,调醇含量至650 ml/L，静置过夜,抽滤,滤渣先后用丙酮、无水乙醇洗3次［3］,即得芦根多糖的粗品。将粗品置圆底烧瓶中(用Sevag 法去除蛋白质) 。用氯仿-正丁醇(4∶1) 溶液对其进行回流40 min ,然后抽滤,弃去滤液, 该操作重复8 次。将滤渣干燥后,再溶于适量水, 过滤, 除去不溶物,滤液进行减压浓缩后, 搅拌下加入950 ml/L 乙醇,调醇含量至650 ml/L 。静置过夜,抽滤,滤渣分别用丙酮、无水乙醇、乙醚洗3 次,干燥,即得芦根多糖，计算得率。多糖(干质量)提取率=m／W。式中，m表示多糖干质量，g；W为供试芦根的质量，g。芦根中多糖含量为0.798％［4］。
        
       精密称取芦根多糖50. 0 mg置100 ml 容量瓶中,加蒸馏水至刻度,摇匀。准确吸取1. 5 ,2. 5 ,3. 0 ml 分别置50 ml 容量瓶中,用蒸馏水稀释至刻度。精密吸取上述溶液各2. 0 ml ,按标准曲线项下操作, 测定吸收度。测定吸收度分别为0.201,0.359,0. 419 。根据回归方程求出含量为750.8 , 774.0 ,747.4 mg/ g ,多糖样品纯度为平均含量为757.4 mg/ g。
       2.3  提取的正交设计及试验
       2.3.1  单因素实验首先，提取温度、提取时间、料水比为考察因素，考察多糖提取率。
        
       提取温度的确定：取10 g芦根，固定提取时间2 h，料水比为1∶6，提取温度分别为80，100和120℃，热水浸提、抽滤，滤液用离子水定容至250 ml,分别吸取1 ml,定容至10 ml容量瓶进行稀释，吸取2 ml定容后溶液，加入5%的苯酚溶液1ml,摇匀后迅速加入5 ml浓硫酸显色，振荡5 min，在沸水浴上加热15 min,取出后于冷水浴中冷却30 min。以空白为参比，用紫外分光光度计在490 nm处测吸光度：吸光度分别为0.305，0.448和0.548。
        
       提取时间的确定：取10 g芦根，料水比1∶6，提取温度100℃，提取时间分别为1，2和3 h ，热水浸提、抽滤，滤液用离子水定容至250 ml,分别吸取1 ml,定容至10 ml容量瓶进行稀释，吸取2 ml定容后溶液，加入5%的苯酚溶液1 ml,摇匀后迅速加入5 ml浓硫酸显色，振荡5 min，在沸水浴上加热15 min,取出后于冷水浴中冷却30 min。以空白为参比，用紫外分光光度计在490 nm处测吸光度。吸光度分别为0．403，0．448和0．579。
       
       料水比的确定：取10 g芦根，控制提取温度100℃ ，提取时间2 h，料水比分别1∶3，1∶6和1∶9，热水浸提、抽滤，滤液用离子水定容至250 ml,分别吸取1 ml,定容至10 ml容量瓶进行稀释，吸取2 ml定容后溶液，加入5%的苯酚溶液1 ml,摇匀后迅速加入5 ml浓硫酸显色，振荡5min，在沸水浴上加热15 min,取出后于冷水浴中冷却30 min。以空白为参比，用紫外分光光度计在490 nm处测吸光度。吸光度分别为0.457，0.448和0.439。
        
       由单因素实验，提取温度为120℃时，提取率较高，另外随温度的升高，多糖易高温变性，所以提取温度控制为120℃为宜；提取时间增加时，提取率增高；料水比为1∶3时提取率较高。
       2.3.2  正交设计实验根据单因素实验结果，以提取温度(A)、提取时间(B)和料水比(C)为影响因素，采用L9(34)正交表设计试验，对提取工艺进行优化。因素水平见表1。表1  正交实验因素水平（略）
       正交实验结果如表2所示。根据表2正交实验结果分析得出，3个因素对芦根多糖浸提的影响顺序大小为提取温度A﹥提取时间B>料水比C。即提取温度对芦根多糖的提取影响最大，3因素3水平最佳提取组合为A3B3C1。即提取以120℃，3 h,1∶3为最优。表2  正交实验结果（略）
        
       2.3.3  微波提取探索正交设计实验以微波火力(A)、提取时间(B)、提取温度(C)［5］、微波加热时间（D）。 因此,本实验采用3因素4水平正交试验设计L9,考察上述4个因素对芦根多糖提取效率的影响,实验因素水平如表3所示。表3  微波辅助正交实验因素水平（略）
       正交PUD 验结果如表4所示。根据表4正交实验结果分析得出，4个因素对芦根多糖提取的影响顺序大小为微波火力A﹥提取时间B>提取温度C>微波加热时间D。微波火力对芦根多糖的提取影响最大，4因素最佳提取组合为A3B3C3D3。即提取以大火，120℃，60 min，8 min为最优。虽然最终得糖率未提高，但是提取多糖纯度有所提高。表4  微波辅助正交实验结果（略）
       2.4  芦根多糖体外抗氧化自由基是生物体内生化反应的普遍中间介质，在正常的生理条件下，自由基的产生与清除可以持续在一个有利无害的极低水平，但在衰老、应激、疾病的情况下却发生自由基对重要生物分子的损伤，现代医学研究表明，自由基被认为是人体衰老和某些慢性疾病发生的原因一，当人体内的自由基产生过多或者清除过慢，就会攻击各种细胞，器官并使之受到损伤，加速机体的衰老过程并诱发各种疾病。
       
       2.4.1  芦根多糖还原力的测定分别取2.5 ml 不同浓度的色素水溶液样品于试管中，依次加入2.5 ml, 0.2 mol/L 磷酸盐缓冲液（PBS，pH=6.6）和2.5 ml 1% K4［Fe(CN)6］，于50℃水浴保温20 min 后，快速冷却，再加入2.5ml 10% TCA，以4 000 r/min 的转速离心10 min，取上清液2.5 ml,依次加入2.5 ml 重蒸水，0.5ml 0.1% FeCl3，充分混匀，静止10 min,在700 nm 处测定吸光度值，以重蒸水作阴性对照。抗坏血酸为阳性对照。结果见图1。
       2.4.2  芦根多糖羟自由基清除能力测定分别取1 ml 7.5 mmol/L 邻二氮菲溶液于试管中，依次加入2 ml 0.2 mol/L 磷酸盐缓冲液（PBS，pH7.4）和1 ml 重蒸水，充分混匀，加入1 ml 7.5 mmol/L FeSO4，混匀，加入1 ml 0.1% H2O2；于37℃水浴60 min 后，在536 nm 处测吸光度值，所测的数据为损伤管的吸光度值A损。未损伤管以1 ml 重蒸水代替损伤管中1 ml 0.1%的双氧水，操作同损伤管，可测得未损伤管的吸光度值A 。样品管以1 ml 样品代替损伤管的1 ml 重蒸水，操作同损伤管，可测得样品管的吸光度值A样。抗坏血酸为阳性对照。结果见图2。
        　
       羟自由基清除率(%)=［A样-A损］/［A未-A损］×100%。
       2.4.3  芦根多糖对脂质体抗氧化活性的测定
       
       试剂配制：脂质体PBS 分散系（LLS）：将300 mg 卵磷脂溶于30 ml 10 mmol/L pH7.4 PBS 的溶液中，冰浴振荡。TCA-TBA-HCl 混合液：15 g TCA，0.37 g TBA，2.1 ml 浓盐酸依次放入100 ml 水中。
        
       测定步骤：分别于样品管依次加入1 ml 卵磷脂溶液（LLS），1 ml 0.4 mmol/L FeSO4，1 ml 0.4 mmol/L 抗坏血酸和1 ml样品，混匀，避光37℃水浴60 min 后加入2 ml TCATBA-HCl 混合液。90～100℃水浴15 min，迅速冷却，以2 000 r/min 旋转离心10 min，取上清液535nm 测吸光度值As。空白管以1 ml 重蒸水代替1 ml 样品，操作同样品管，可测得空白管的吸光度Ac，参比管1 ml卵磷脂溶液以重蒸水代替。抗坏血酸为阳性对照。
        
       抑制率（%）=（Ac-As）/Ac×100%。
       2.4.4  芦根多糖抗氧化从还原力能力上来看，芦根多糖有很强的还原能力，其还原能力仅稍次于抗坏血酸。芦根多糖对羟自由基的清除能力可以看出，芦根多糖对羟自由基的清除能力较抗坏血酸来说较弱。由芦根多糖对脂质过氧化的抑制作用结果作回归处理得回归方程为A=0.071 40 X+0.068 64 （R2=0.999 05)。标准曲线可见多糖的吸光度在小于等于0.88时与多糖的浓度成正相关。从这三方面来看，芦根多糖具有一定的抗氧化能力。
       3  讨论
           
       本研究利用了微波法，增加了芦根多糖提取的效率，为芦根多糖提取的最佳工艺的研究提供了参考；本研究还证实了芦根多糖具有一定的抗氧化活性，前人的研究表明抗氧化活性物质对癌症、衰老、脑血管疾病等有一定的功效［6～8］，所以，作为天然的抗氧化剂，芦根多糖可能在疾病的预防和治疗方面发挥作用，这些还有待于进一步研究与证实。
       【参考文献】
         　　［1］蔡孟深，李中军.糖化学（基础、反应、合成、分离及结构）［M］.北京：化学工业出版社，2007：362.
       
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       ［3］李立华，张国升.芦根多糖保肝作用及抗纤维化的研究［J］.安徽中医学院学报，2007,26(5)：32.
       
       ［4］刘 婷，周光明.多糖的提取和分析方法［J］.化工时刊，2008，22（3）：66.
       
       ［5］卢 樱.微波辅助萃取在天然植物有效成分提取的应用进展［J］.陕西农业科学，2007,5：71.
       
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       ［7］吴石磊，徐 立，王茜龄.桑树中抗氧化物质的研究进展［J］.蚕学通讯，2008,2：22.
       
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