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       【摘要】 
       目的探讨美洲大蠊提取物对四氯化碳（CCl4）所致实验性肝纤维化的影响。方法采用CCl4复制小鼠肝纤维化模型，同时用0.25 g/kg的美洲大蠊提取物灌胃治疗，测定血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)、白蛋白(ALB)、透明质酸(HA)，Ⅲ型前胶原(PC-Ⅲ), IV型胶原(IV-C)，层粘蛋白(LN)，并以光镜现察肝脏组织学改变，进行炎症活动度分级及肝纤维化分期。结果美洲大蠊提取物有降低ALT，AST的作用，并显能著降低HA，LN，PCⅢ和Ⅳ-C。经治疗后的肝胜细胞变性、坏死及纤维组织增生明显减少。结论美洲大蠊提取物具有抗实验性肝纤维化的作用。
       【关键词】  美洲大蠊提取物； 肝纤维化； 四氯化碳； 小鼠
          昆虫作为一类新的医药资源宝库，越来越受到国内外学者的重视。近年研究表明，美洲大蠊提取物（Abstract of Periplaneta americana，APA）对实验性肝损伤有较好的保护作用，能抑制雏鸭体内鸭乙型肝炎病毒的复制［1］。但对肝纤维化是否有作用，目前未见报道。为探讨APA对肝纤维化的防治效果，本研究用CCl4复制小鼠肝纤维化模型，初步观察APA对肝纤维化影响。
       1  材料与方法
       1.1  动物健康雄性昆明种小鼠40只，胎龄3～4周，体质量18～22 g，由昆明医学院动物科提供，实验过程中饲养条件相同，而且定期清洁,消毒。
       1.2  试剂CCl4，分析纯，由天津化学试剂三厂生产，批号：080618。橄榄油，化学纯，由上海国药集团化学试剂有限公司提供，批号： F20080219。透明质酸(HA)、层粘蛋白(LN)、Ⅲ型前胶原(PC-Ⅲ)、IV型胶原(Ⅳ-C)、 肝纤维化放免试剂盒由北京北方生物技术研究所提供，批号：081020。Masson试剂盒由福州迈新生物有限公司提供，批号：811048003。
       1.3  主要药物APA原药，为昆明赛诺制药有限公司提供，批号：03122001。用蒸馏水配制成浓度为1.25 %的混悬液。临用时用力摇匀。动物用量均按生药量计算。秋水仙碱（购自云南植物药业有限公司，批号：20080401）1 mg溶于100 ml蒸馏水中，冰箱保存备用。
       2  方法
       2.1  动物模型的制备20%CCl4橄榄油溶液按0.05 ml/10 g体质量给小鼠颈背部皮下注射，2次/周，连续6周。
       2.2  动物分组40只小鼠随机分成4组，10只/组，即正常对照组、模型组、APA治疗组、秋水仙碱对照组。正常对照组动物仅皮下注射橄榄油溶液；模型组和药物实验组动物皮下注射20%CCl4橄榄油溶液（0.05 ml/10 g体质量），2次/周, 连续6周。造模当日即开始灌胃给予药物或蒸馏水，1次/d，连续6周，直至动物处死：空白对照组及模型组动物按0.2 ml/10 g体质量灌胃蒸馏水；秋水仙碱组：按0.1 ml/10g体重灌胃，用量为0.1 mg/kg；APA治疗组：给1.25%原药0.2 ml/10g体质量灌胃（0.25 g/kg，相当于临床60kg成人每日用量的25倍）。
       2.3  观测指标与标本采集实验过程中观察动物的体质量、食欲、神态等一般状况。分别于实验开始后的第6周末剖杀动物，采集血液和肝脏标本。剖杀前24 h禁食不禁水，剖杀时先以乙醚吸入麻醉后摘眼球用毛细玻管眼眶取血供生化检测，再立即剖杀动物，取肝左叶中部、左叶及右上叶前部，进行组织病理检查。采用放免法（按试剂盒说明书进行）测定血清HA, LN，PC-Ⅲ，Ⅳ-C水平。采用全自动生化分析仪测定ALT，AST，TBiL和ALb。
       2.4  病理组织学检查肝组织行石蜡包埋，常规切片，HE及Masson染色，光镜下观察肝组织学改变及胶原纤维增生情况，按照《病毒性肝炎防治方案》的标准［2］，进行炎症活动度分级及肝纤维化分期。有两期以上肝纤维化形成，即确定肝纤维化模型复制成功。
       2.5  统计方法采用SPSS13.0统计软件分析数据，实验所得数据用±s表示，组间两两比较采用q检验，等级资料用秩和检验。 α=0.05作为显著性检验标准。P< 0.05，结果有统计学意义。
       3  结果
       3.1  小鼠一般情况空白对照组处死前均存活，模型组实验中死亡1只，合计死亡1只。死亡者未列入统计。
       3.2  APA对实验性肝纤维化小鼠肝功能的影响APA治疗组及秋水仙碱组转氨酶的升高均明显低于模型组，且APA治疗组的降酶作用优于秋水仙碱组。模型组与药物组之间的ALB及TB无显著性差异见表1。表1  APA对实验性肝纤维化小鼠肝功能的影响(略)
       3.3  APA对实验小鼠肝纤维化指标的影响APA组及秋水仙碱组血清中的HA、LN、PCⅢ、Ⅳ-C均明显低于模型组（表2）。
       3.4  病理形态学表现肝组织切片HE染色观察，正常对照组肝小叶结构完整，无肝细胞变性、坏死，无炎细胞浸润及纤维组织增生（见图1）。模型组肝组织损害严重，肝小叶结构破坏，肝细胞明显肿胀、变性，其中多为脂肪变性，部分呈气球样变，肝小叶周围明显坏死，胶原增生显著，形成部分假小叶（见图2）。APA治疗组纤维增生较少，局限于汇管区，未出现假小叶的形成（见图3）。秋水仙碱组改善肝纤维化作用明显（见图4）。表2  APA对小鼠肝纤维化指标的影响(略)
        肝组织切片Masson染色观察，正常对照组小鼠肝小叶结构完整,肝索排列整齐,于管壁可偶见少量亮绿着色,提示正常肝组织仅极少量胶原组织沉积于中央静脉壁（见图5）。模型组小鼠肝脏体积缩小，颜色呈现暗红色，部分表面呈结节状，边缘较钝。
       Masson染色可见肝小叶结构破坏，肝细胞索排列紊乱，汇管区扩大增宽，且有肝细胞变性、坏死以及炎细胞浸润，纤维间隔广泛形成（见图6）。美洲大蠊提取物组和秋水仙碱组:肝小叶结构破坏程度、肝细胞变性坏死及炎细胞浸润程度较模型组轻。见图7～8。
       3.5  APA对小鼠肝纤维化分期（S）的影响经秩和检验，APA治疗组及秋水仙碱组与模型组小鼠的肝纤维化分期（S）的比较组间差异有统计学意义(P<0.01)。APA组和秋水仙碱组小鼠的S均明显较模型组轻(P<0.01)。见表3。表3  各组小鼠肝纤维化分期（略）
       4  讨论
        肝纤维化是多种慢性肝病的共同病理基础，所以，抗肝纤维化已经成为慢性肝病对因治疗之外的重要治疗环节［3］。肝纤维化实质是细胞外基质（extracellularmatrix，ECM）合成与代谢失衡,导致ECM异常沉积。ECM包括胶原、非胶原糖蛋白及蛋白多糖，其中胶原是最重要的ECM。肝脏胶原有Ⅰ，Ⅲ，Ⅳ，Ⅴ，Ⅵ型，以Ⅰ，Ⅲ型为主。其水平可反映肝纤维化的程度,并与病变程度呈正相关［4］。目前普遍认为，肝纤维化病理过程是可逆的［5］。在慢性病毒性肝炎病因治疗之同时，根据疾病发展的不同阶段，采取抗肝纤维化治疗不失为一种有效手段。近年来，关于抗肝纤维化的研究有不少报道，但目前疗效确切、不良反应少的抗纤维化西药很少，大多还处在实验研究阶段［2，6］。自20世纪70年代开始，国内外学者致力于中医药抗肝纤维化的研究，发现中药在抗肝纤维化治疗中具有明显的优势，包括单味药，复方的研究［6，7］，但疗效均不肯定，且主要来源于植物或动物。而昆虫作为一类新的医药资源宝库，其药用价值值得深入研究。
        肝龙胶囊是利用现代工艺从美洲大蠊Periplaneta americana L.中提取的以黏糖氨酸为主要有效成分的APA制剂，由昆明赛诺制药有限公司生产。近年研究表明，APA对实验性肝损伤有较好的保护作用，能抑制雏鸭体内鸭乙型肝炎病毒的复制［1］，并降低四氯化碳肝损伤小鼠血清SGPT值并减轻肝细胞损伤［8］。临床观察提示，APA可能具有抗HBV作用（李成芸等《中药“肝龙”胶囊治疗慢性乙肝近期疗效观察》第13次全国中西医结合肝病学术会议，2004）。
        本研究初步观察了美洲大蠊提取物对CCl4所致小鼠肝纤维化的影响，结果证实， APA能降低CCl4肝纤维化小鼠的血清转氨酶，还能明显降低HA，LN，CⅣ和PCⅢ水平，提示APA具有较好的抑制细胞外基质的合成，以及促进其降解的作用。通过病理肝纤维化程度分级分析可知, APA能明显改善受损肝脏的病理形态，降低纤维化程度。提示美洲大蠊提取物对CCl4所致小鼠肝纤维化具有一定的防治作用。
       【参考文献】
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