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       【摘要】 
       目的用高效液相色谱法比较蒙药材草乌及其炮制品中乌头碱、次乌头碱、新乌头碱的含量。方法色谱柱为Diamonsil C18柱（250 mm×4.6 mm,5 μm）；流动相A为乙腈-四氢呋喃（25∶15, V/V），B为 0.1 mol·L-1醋酸铵-冰醋酸(100∶0.05,V/V)，梯度洗脱；检测波长为235 nm；流速1.0 ml·min-1；柱温为30℃；进样量10 μl。结果蒙药材草乌经特殊炮制后，炮制品中乌头碱、次乌头碱、新乌头碱的含量均低于草乌生品，诃子制草乌中含量最低，甘草制草乌含量次之，酸奶制草乌含量最高。结论3种炮制方法使草乌药材中双酯型生物碱含量大大降低，可用于指导蒙医临床用药。
       【关键词】  草乌；炮制品；高效液相色谱法；乌头碱；次乌头碱； 新乌头碱
       Content Comparison of Aconitine, Hypaconine and Mesaconitine in Radix Aconiti Kusnezoffii and its Mongolian Distinct Preparations by HPLC
       L Ying, WANG Dong, LIN Yan, WANG Wei, SUN Lixin
       1.School of Pharmacology，Shenyang Pharmacological University，Shenyang 110016，Liaoning，China； 2.Chifeng Institute for  Drug Control, Chifeng 024000，Inner Mongolian，China; 3.Inner Mongolian Institute for Food and Drug Control,Huhehaote 010020，Inner Mongolia，China
       Abstract:ObjectiveTo compare the contents of aconitine，hypaconitine and mesaconitine in Radix Aconiti Kusnezoffii and its mongolian distinct preparations by HPLC.MethodsDiamonsil C18(250 mm×4.6 mm,5 μm) was used as chromatographic column, acetonitrile-tetrahydrofuran(25∶15,V/V) and 0.1 mol·L-1 ammonium acetate - acetic acid (100∶0.05,V/V) in gradient elution mode as mobile phase. The flow rate was set at 1.0 ml·min-1, the detection wavelength at 235 nm and the column temperature was at 30℃.ResultsAfter Radix Aconiti Kusnezoffii was processed by Mongolian distinct technology, the contents of aconitine, hypaconine and mesaconitine in its preparations were less than those in unprocessed Radix Aconiti. Kusnezoffii, and in these preparations the total content of three alkaloids thin myrobalan preparation of Radix Aconiti Kusnezoffii was minimum,that in liquorice preparation of Radix Aconiti Kusnezoffii was second,and that in acidophilous milk preparation of Radix Aconiti Kusnezoffii was maximum.ConclusionThe contents of diesters alkaloid in Radix Aconiti Kusnezoffii processed by three Mongolian distinct technology decrease largely, which can help to guide traditional Mongolian clinical medication.
       Key words:Radix Aconiti Kusnezoffii；  Mongolian distinct preparations；  HPLC；  Aconitine；  Hypaconitine；  Mesaconitine
       
       草乌为毛茛科植物北乌头Aconitum kusnezo ffii Reichb.的干燥块根，具有祛风除湿、温经止痛功能［1］，为蒙医临床常用药物之一。草乌主要成分是生物碱，生物碱既是其生理活性物质，也是毒性物质，尤其是二萜双酯型生物碱毒性最强，如乌头碱、次乌头碱、新乌头碱［2］。其用药剂量与中毒剂量接近，经炮制加工后，毒性大大降低。因此，炮制过程中应严格控制双酯型生物碱的转化程度，防止炮制不充分，有毒成分含量偏高；炮制太过，有效成分流失严重，影响药效。不同蒙药炮制方法对草乌中所含双酯型生物碱含量的影响报道较少，为保证蒙医用药安全，比较草乌药材及炮制品中双酯型生物碱的含量具有十分重要的意义。
       1  仪器与材料
           
       LC-20AT高效液相色谱仪（SPD-M20A二极管阵列检测器，SIL-20AHT自动进样器，CTO-20A柱温箱，LC solution色谱工作站，日本岛津公司），ME5型电子分析天平（瑞士梅特勒-托利多公司），RE-52AA型旋转蒸发器（上海亚荣生化仪器厂）。
        
       对照品乌头碱、次乌头碱、新乌头碱（批号分别为110720-200410、110798-200404、110799-200404，中国药品生物制品检定所），乙腈（色谱纯，CALEDON LABORATORIES LTD.Canada）、四氢呋喃（色谱纯，天津市光复精细化工研究所），纯化水（自制），其余试剂（分析纯，市售）。
        
       草乌药材，采自内蒙古兴安盟，经内蒙古食品药品检验所蒙药室康双龙教授鉴定为毛茛科植物北乌头Aconitum kusnezo ffii Reichb.的干燥块根。诃子制草乌炮制品、甘草制草乌炮制品、酸奶制草乌炮制品（内蒙古食品药品检验所蒙药室炮制）。
       2  方法与结果
       2.1  对照品溶液与供试品溶液的制备
       2.1.1  对照品溶液的制备精密称取乌头碱、次乌头碱和新乌头碱对照品各约12 mg，置25 ml量瓶中，加异丙醇-氯仿（1∶1, V/V）溶解并稀释至刻度摇匀。置冰箱4 ℃冷藏，备用。
       2.1.2  供试品溶液的制备取草乌生品或炮制品粉末约2 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加浓氨试液1 ml，放置片刻，精密加入异丙醇-乙酸乙酯（1∶1, V/V）50 ml，称定重量，超声处理（功率150 W，频率40 kHz）30 min，取出，放至室温，再称定重量，用异丙醇-乙酸乙酯（1∶1, V/V）补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液25 ml，置旋转蒸发器中，40 ℃以下减压回收溶剂至干，残渣用异丙醇-氯仿（1∶1, V/V）溶解并定容置5 ml量瓶中，用微孔滤膜（0.45 μm）滤过，作为供试品溶液。
       2.2  色谱条件色谱柱为Diamonsil C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相为A为乙腈-四氢呋喃（25∶15，V/V），B为0.1 mol·L-1醋酸铵-冰醋酸（100∶0.05，V/V），梯度洗脱：0～15 min，VA：85→78，VB：15→22，15～60 min，VA∶VB=78∶22；流速：1.0 ml·min-1；检测波长235 nm；柱温30 ℃；进样量10 μl。
       2.3  系统适用性试验取供试品溶液，在上述色谱条件下进样。以乌头碱、次乌头碱和新乌头碱色谱峰计算，理论板数均在5 000以上时，色谱峰对称因子0.95～1.05，乌头碱、次乌头碱和新乌头碱色谱峰与其他成分分离度大于1.5。结果见图1。
       2.4  线性关系考察分别取对照品溶液0.1，0.2，0.5，1.0，2.0，3.0，4.0 ml，置5 ml量瓶中，加异丙醇-氯仿（1∶1,V/V）稀释至刻度，取上述溶液各10 μl，分别注入液相色谱仪，按“2.2”项色谱条件测定峰面积，以对照品峰面积为纵坐标（Y），对照品进样质量为横坐标(X)，绘制标准曲线，得回归方程分别为：乌头碱Y=4.070×105X+82.47，r=0.999 7；次乌头碱：Y=3.978×105X +7.269×103，r=0.999 9；新乌头碱Y=3.965×105X +6.805×103，r=0.999 6。结果表明乌头碱、次乌头碱和新乌头碱分别在0.101～4.043，0.089～3.546，0.101～4.040 μg呈良好的线性关系。
       2.5  精密度实验精密吸取混合对照品溶液，在“2.2”项色谱条件下重复进样5次，记录乌头碱、次乌头碱、新乌头碱的峰面积，其RSD分别为0.71%，0.82%，0.70%。
       2.6  溶液稳定性实验取草乌生品粉末(批号: 070906)适量，按“2.1”项方法制备供试品溶液，在“2.2”项色谱条件下，分别于配制后0，2，4，8，12，24 h进样测定，记录色谱图。结果乌头碱、次乌头碱、新乌头碱RSD分别为0.73%，0.81%，0.70%，表明溶液在24 h内基本稳定。
       2.7  重复性实验取同一批草乌生品粉末(批号: 070906)6份，按“2.1”项方法制备供试品溶液，并按“2.2”项色谱条件进样测定，结果样品中乌头碱、次乌头碱、新乌头碱平均含量的RSD分别为1.8%，2.0%，1.7%。
       2.8  回收率实验取已知乌头碱、次乌头碱、新乌头碱含量的草乌生品粉末(批号: 070906)6份，各约1 g，精密称定，每份分别加入乌头碱、次乌头碱和新乌头碱对照品适量，按“2.1”项方法制备，“2.2”项色谱条件下测定，计算回收率。结果表明，乌头碱、次乌头碱、新乌头碱平均回收率分别为99.7%，100.9%，99.5%，RSD分别为1.3%，0.9%，1.2%。结果见表1。表1  回收率实验结果（略）
       2.9  样品测定取草乌生品粉末(批号: 070906)及以本批次生草乌为原料的不同炮制品按“2.1”项方法制备供试品溶液，按“2.2”项色谱条件进样测定，根据3个成分的线性回归方程，对各样品中的成分含量进行计算。结果见表2。表2  样品中乌头碱、次乌头碱、新乌头碱的测定结果（略）
       3  讨论
           
       本文样品提取采用超声波法，曾考察了不同超声时间（15，30，45 min）对含量的影响，结果超声处理30 min时，含量不再增加，故本文选择超声处理30 min。
        
       目前文献报道的方法中多采用二乙胺或三乙胺为流动相［2］，碱性较强，易破坏色谱柱固定相。本文参考文献［3］采用乙腈-四氢呋喃-醋酸铵-冰醋酸梯度洗脱系统，测定草乌和草乌炮制品中生物碱成分，专属性强，可用于草乌药材及炮制品的质量控制。
        
       由样品测定结果可知，蒙药炮制草乌后，炮制品中乌头碱、次乌头碱、新乌头碱的含量均低于草乌生品，诃子制草乌中含量最低，甘草制草乌含量次之，酸奶制草乌含量最高。这为草乌类药材资源的应用提供了参考数据，哪一种炮制方法最好还需要通过药理实验进一步考察。
       【参考文献】
         　　［1］国家药典委员会.中国药典,Ⅰ部［S］.北京：化学工业出版社，2005:163.
       
       ［2］李娅萍，田颂九，王国荣，等.乌头类药物的化学成分及分析方法概况［J］.中国中药杂志，2001，26（10）：659.
       
       ［3］张聿梅，鲁 静，蒋 渝，等.川乌和制川乌中单酯及双酯型生物碱成分的含量测定［J］.药物分析杂志，2005，25（7）：807.