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       【摘要】 
       目的探索分离三七茎叶中的叶苷和总黄酮的工艺条件及参数。方法以静态饱和吸附量、动态比吸附量、比洗脱量为考察指标，比较不同大孔树脂富集纯化三七茎叶叶苷和总黄酮的性能，并对最佳树脂纯化工艺进行筛选。结果AB-8树脂综合性能最佳，其吸附分离工艺条件为：上样液浓度为叶苷1.806 0 mg/ml,总黄酮0.7852 mg/ml，上样液以1.0 BV/h吸附流速上样，纯水冲洗，60%乙醇洗脱后，再用95%乙醇洗脱。结论经大孔树脂纯化后的三七茎叶有效部位中，总黄酮加叶苷的质量分数达90%，说明该纯化工艺是可行的。
       【关键词】  三七茎叶； 大孔吸附树脂； 有效部位
        三七茎叶为五加科植物三七Panax notoginseng (Burk) F. H. Chen的地上部分，三七叶苷及黄酮是三七茎叶中的有效部位。三七总黄酮与皂苷合用，生理活性最强，分开使用则证明总黄酮能显著增加心肌冠脉流量［1］。现代研究表明，三七叶苷有延年益寿和增强机体活力的作用［2］；三七黄酮类成分具有增加冠状动脉血流、降低心肌耗氧量、抗心律失常、抗氧化、抗衰老以及增强机体免疫力等功能，具有治疗老年性痴呆症的可能，其在心脑血管疾病防治及保健等方面有广泛的应用前景［3］。三七茎叶在三七道地产地文山资源丰富，大约每年可收获10 000 t，本实验以三七茎叶为原料，以提取物收率（提取物质量/原料质量）和叶苷、总黄酮的纯度为考察指标，采用醇提-树脂法对三七叶苷及黄酮的提取分离与纯化工艺进行了研究，以期为三七茎叶的开发提供依据。
       1  材料
        三七茎叶购自云南文山三七国际交易市场；人参皂苷Re对照品购于中国生物制品检定所；AB-8树脂为天津南开大学化工厂产品，HPD-100为河北沧州宝恩化工有限公司产品，D101-大孔吸附树脂(华北地区特种化学试剂开发中心)；其他试剂均为分析纯。岛津2550型紫外分光光度计（日本岛津公司）；DZF-6020真空干燥箱（上海一恒科技有限公司），R201D-Ⅱ旋转蒸发仪（上海申顺生物科技有限公司）。
       2  方法与结果
       2.1  工艺流程见图1。
       2.2  三七叶苷的含量测定［2］
       2.2.1  标准溶液的配制精密称取人参皂苷Re对照品0.020 0 g用甲醇溶解并定容至10.0 ml，即每毫升含人参皂苷Re 2.0 mg。
       2.2.2  样品测定精密吸取待测液1.0ml于蒸发皿，置于60℃水浴挥干；同样精确吸取人参皂苷Re标准溶液0.1 ml于蒸发皿中，置于60℃水浴挥干。在已挥干的蒸发皿中，分别准确加入0.2 ml质量分数为5%的香草醛冰醋酸溶液，0.8 ml高氯酸，混匀后移入5 ml具塞刻度离心管中；于60℃水浴加热10 min，取出后用流水冷却，再准确加入5.0 ml冰醋酸溶液摇匀，以1 cm比色池于560 nm波长处测定吸收值［4］，并通过下式计算求出含量。
        叶苷含量（mg/ml）=对照品量×A样/A对样品体积
        式中：A样，样品吸收值；A对，对照品吸收值；对照品量，标准管人参皂苷Re的量(mg)；样品体积(ml)。
       2.3  黄酮含量测定［4］采用分光光度计法测定总黄酮含量，即利用黄酮类化合物与铝盐反应，产生红色络合物，以芦丁为对照品于500 nm波长处测定吸收值。
       2.3.1  标准溶液的配制［5］精密称取于120℃干燥至恒重的芦丁对照品48.35 mg置于50 ml容量瓶中，加乙醇溶解至刻度，摇匀，精确吸取此溶液10.0 ml置于50 ml容量瓶中，再加水至刻度，摇匀，即得标准溶液。
       2.3.2  标准曲线的制作精密吸取芦丁标准溶液1.0，2.0，3.0，4.0，5.0，6.0 ml分别置于25ml容量瓶中，各加水至6 ml，再加入5%的亚硝酸钠溶液1.0 ml，混匀，放置6 min，加入10%硝酸铝溶液1.0 ml，混匀，放置6 min，加入4%氢氧化钠10.0 ml再加水至25 ml，放置15 min（不加芦丁作空白对照）。按分光光度计法在500 nm波长处测定吸收值。所取标准溶液的浓度和吸收度数据经回归处理，得回归方程：A= 0.219 6C－0.011 2，其线性范围为0～0.6 mg 相关系数r=0.999 3。
       2.4  上柱液的制备及预处理取干燥的三七茎叶，用70%乙醇溶液为溶剂，料液比为1∶50（g∶ml），回流提取1.5 h，提取2次，合并提取液，通过减压蒸馏回收乙醇溶液，得到的固形物用一定量的热蒸馏水溶解、过滤后作为样品溶液，总黄酮浓度为1.570 4 mg/ml，叶苷浓度为3.6120 mg/ml。
       2.5  不同型号树脂筛选
       2.5.1  大孔吸附树脂预处理先将树脂放在水中浸泡，除去浮在表面的树脂(反复几次)，再用95%乙醇浸泡24 h，使树脂充分溶胀，湿法装柱。用95%乙醇以2 BV/h的流速通过树脂层，流至流出液加蒸馏水不变白色浑浊为止。再用蒸馏水以同样流速洗尽乙醇。将5%的盐酸溶液以4～6 BV/h流速通过树脂层，并浸泡2～4h，然后用蒸馏水以同样流速洗至中性，再用2%的NaOH溶液以4～6 BV/h流速进行碱洗，用去蒸馏水洗至中性即处理完毕。
       2.5.2  静态吸附试验由于三七叶苷和黄酮的极性较弱，根据相似相溶原理，弱极性的化合物更易被弱极性的树脂所吸附，故本实验选择D101（非极性）、AB-8（弱极性）、HPD-100（非极性）作为备选树脂。在带塞的锥形瓶中，各加入取处理好的树脂1 ml和150 ml上柱液于25℃恒温摇床中，振荡24 h，充分吸附后，过滤，取滤液，分别按“2.2”和“2.3”项下方法测定样品吸附前后叶苷和总黄酮的浓度,按下式计算各种树脂的静态饱和吸附量(mg/ml湿树脂)。
        吸附量（mg/ml）=C0-CrW树脂×V
        式中C0和Cr分别为吸附前后提取液中的质量浓度(mg/ml)，W树脂为树脂的体积(ml)，V为溶液的体积(ml)。结果见表1。表1  树脂静态吸附结果（略）
        试验结果表明AB-8、HPD-100对叶苷及总黄酮静态饱和吸附量均较大，D101树脂对叶苷及总黄酮的吸附能力较小。
       2.5.3  树脂动态吸附实验比吸附量是评价树脂真实吸附能力的指标，是选择树脂种类的参数；比洗脱量是评价树脂解吸能力与洗脱剂的洗脱能力的指标，也是选择树脂种类及洗脱剂的参数。本实验以比吸附量和比洗脱量为指标，对上述3种树脂进行筛选。将经预处理的树脂30 ml，湿法装柱，径高比为1∶10，上柱液以1.0 BV/h流速上样，随时采用FeCl3乙醇溶液检测流出液，以FeCl3反应变绿为泄露，停止上样，收集过柱液；纯水冲洗至流出液颜色极淡，然后用95%乙醇洗脱，流速为1.0 BV/h，洗至无明显FeCl3颜色反应。分别收集各支柱子的洗脱液，定容，按“2.2”及“2.3”项下方法测定叶苷及总黄酮含量，计算比吸附量、吸附率、比洗脱量、洗脱率。结果见表2～3。表2  总黄酮动态吸附及洗脱试验结果（略）
       
       比吸附量（mg/ml）=M上-M残-M水洗W
        M上为上柱液中指标成分的含量，M残为流出液中指标成分含量；M水洗为水洗脱液中指标成分含量；W为树脂体积(ml)。
        吸附率（%）=C0-CrC0×100%
        C0为上柱液指标成分浓度(mg/ml)；Cr为过柱液中指标成分浓度(mg/ml)。
        比洗脱量=M洗脱W；M洗脱为洗脱液中指标成分的含量，W为树脂体积（ml）。
        洗脱率（%）=比洗脱量比吸附量×100%
        表2～3的结果表明，AB-8、HPD-100型大孔树脂对叶苷及总黄酮的动态吸附量、洗脱率均较大，但综合比较可以发现，AB-8树脂的综合收率（叶苷比洗脱量加总黄酮比洗脱量）最好，因此将AB-8型大孔吸附树脂作为进一步分离纯化三七茎叶中叶苷和总黄酮所用树脂。表3  叶苷动态吸附及洗脱试验结果（略）
       2.6  纯化工艺参数筛选
       2.6.1  上样吸附参数的筛选
       
       上样浓度筛选：取处理好的AB-8大孔吸附树脂，湿法装柱，取5份上柱液，分别调整总黄酮浓度为0.196 3，0.392 6，0.785 2，1.570 4，3.1408mg/ml，叶苷浓度为0.451 5，0.903 0，1.806 0，3.612 0，7.2240 mg/ml。以1BV/h流速上样，然后用纯水洗脱至颜色极淡，计算比吸附量。结果见表4。表4  上柱液浓度对比吸附量的影响（略）
        从表4可以看出，AB-8树脂的比吸附量随着上样液质量浓度的增加而增高，当上样液质量浓度升高到总黄酮浓度0.785 2 mg/ml、叶苷浓度为1.806 0 mg/ml时，AB-8树脂的比吸附量趋于饱和。
        吸附流速的筛选：精确量取相同体积的上述项中确定的最佳上样液浓度的上样液5份，分别以0.5，1，1.5，2，2.5 BV/h对相同型号层析柱、相同体积的AB-8树脂柱进行吸附，然后用蒸馏水洗至颜色极淡，用“2.2”及“2.3”项下的方法测定叶苷及总黄酮的含量,计算出比吸附量。结果见表5。表5  吸附流速对比吸附量的影响（略）
        从表5可以看出，随着吸附流速的增加，树脂比吸附量呈显著下降趋势，以0.5 BV/h和1.0 BV/h的流速吸附效果基本相近最佳，考虑到工作量及工作效率等因素，以1.0 BV/h的流速吸附效果最佳。流速过快则树脂泄漏严重，有部分树脂吸附还未达到饱和就已经泄漏，吸附效果明显下降。但若流速过慢，工作量大且工作效率低。
       2.6.2  洗脱参数筛选
        叶苷与总黄酮的梯度洗脱：将总黄酮浓度为0.785 2 mg/ml、叶苷浓度为1.806 0 mg/ml，上样液以1.0 BV/h流速上样达饱和时，用蒸馏水洗至颜色极淡，分别用10，20，30，40，50，60，70，80，90，100%的乙醇溶液以1.0 BV/h的流速进行洗脱得不同洗脱液，用“2.2”的方法进行测定叶苷含量；用“2.3”的方法进行测定总黄酮含量。结果见图2。从图2可以看出，用60%乙醇溶液可以把吸附在AB-8树脂上的大部分叶苷洗脱下来，再用95%乙醇溶液（乙醇的一般商品规格）可以把吸附于AB-8树脂上的大部分总黄酮洗脱下来。但由图2可以看出：叶苷与总黄酮仍有一定的交叉，分析其原因：大孔树脂吸附原理主要为物理吸附，所以比表面积增加，表面张力随之增大，吸附量提高，对吸附有利。但树脂的实际应用是由树脂的极性、孔径、孔容及均一性的综合性能决定的。因此，出现此结果，可能是大孔吸附树脂的均一性差以及装柱效果不理想等因素所造成的。
        综合以上分析，采用60%的乙醇溶液洗脱，富集以叶苷为主要成分的三七茎叶有效部位(含叶苷87.0%，总黄酮含量为6.4%)；用60%乙醇溶液洗脱后，再以95%的乙醇溶液洗脱，富集以总黄酮为主要成分的三七茎叶有效部位（叶苷含量为13.3%，总黄酮含量为76.5%)。
        洗脱流速的筛选：根据上述的筛选结果，以60%和95%的乙醇溶液为洗脱剂，分别采用不同的洗脱流速进行梯度洗脱。结果见表6。表6  洗脱流速对比洗脱量的影响（略）
        从表6的实验结果可以看出，当洗脱流速大于1.5 BV/h时，无论是采用60%乙醇溶液，还是95%的乙醇溶液进行洗脱，叶苷和黄酮的洗脱率均大幅度下降，故采用1.5 BV/h的洗脱流速进行洗脱。
       2.7  重复性实验采用上样液的总黄酮浓度0.785 2 mg/ml,叶苷浓度为1.806 0 mg/ml的质量浓度上样，以1.0 BV/h的流速吸附，用蒸馏水洗至颜色极淡，以60%的乙醇溶液为洗脱剂，洗脱流速为1.5 BV/h，洗脱直至FeCl3乙醇溶液呈现颜色反应，收集洗脱液，改用95%乙醇溶液继续洗脱，至FeCl3乙醇溶液不呈现颜色反应停止洗脱，收集洗脱液，减压蒸馏回收溶剂，于60℃真空干燥，测定总黄酮及叶苷的含量，并计算提取物总收率。重复实验6次。结果见表7。表7  重复性实验结果（略）
        表7的实验结果表明，采用该工艺提取分离三七茎叶中的叶苷及总黄酮重复性较好，工艺稳定。
       3  讨论
        利用醇提、AB-8大孔吸附树脂纯化工艺提取分离三七茎叶中叶苷及黄酮的方法，采用岛津2550型紫外分光光度计测定叶苷及黄酮的含量，方便快捷，操作成本低。通过考察上样液浓度、上样液洗脱速率及乙醇洗脱剂浓度对三七茎叶中叶苷及总黄酮分离纯化的影响，确立了提取分离三七叶苷及总黄酮的最佳工艺条件。其工艺为：上样液的总黄酮浓度0.785 2 mg/ml、叶苷浓度为1.806 0 mg/ml的质量浓度上样，以1.0 BV/h的流速吸附，用蒸馏水洗至颜色极淡，以60%的乙醇溶液洗脱直至FeCl3乙醇溶液呈现颜色反应，收集洗脱液，改用95%乙醇溶液继续洗脱，至FecI3乙醇溶液不呈现颜色反应停止洗脱，收集洗脱液，减压蒸馏回收溶剂，于60℃真空干燥至恒重，得到提取物。
        通过该工艺分离得到的三七茎叶有效部位，60%乙醇溶液洗脱部位以叶苷为主要成分，其叶苷含量达到87%左右，总黄酮含量达到6.7%左右；95%乙醇溶液洗脱部位以总黄酮为主要成分，其总黄酮含量为76.5%左右，叶苷含量为13%左右。可以根据提取需要，选择95%乙醇溶液洗脱，也可分别用60%和95%乙醇溶液进行分部洗脱。醇提取物加水溶解后，通过大孔吸附树脂，先用洗脱除尽游离糖等非皂苷成分后，改用30%～60%乙醇洗脱，皂苷被洗脱下来，而总黄酮成分被吸附在大孔树脂上［5］。
       
       从三七茎叶中提取分离叶苷和总黄酮，使用树AB-8脂法可作为初步分离的手段，但从分离效果可以看出，叶苷和黄酮还存在着较大的交联，对大孔吸附树脂的型号还需要进一步筛选，提高其分离度，以期获得较纯的三七叶苷和总黄酮。
       【参考文献】
         　　［1］魏均娴，杜元冲.三七——现代科学研究与应用［M］.昆明：云南科技出版社，1996：31.
       
       ［2］吴少雄，王保兴，郭祀远,等. 三七叶苷的提取分离与纯化［J］.食品与发酵工业，2005，31(1)：149.
       
       ［3］聂 丽，罗万芳，王兴文.大孔树脂分离纯化三七黄酮类成分研究［J］.云南中医学院学报，2007，30（1）：10.
       
       ［4］张素琼，侯晋军，李青山.大孔吸附树脂同步分离纯化罗布麻叶总黄酮和总鞣质的研究［J］.中国中药杂志，2008，33（10）：1141.
       
       ［5］陈业高.植物化学成分［M］.北京：化学工业出版社，2004：175.