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       【摘要】 
       目的观察散结抗瘤方对S180荷瘤小鼠的抑瘤作用及对血管内皮生长因子（VEGF）、缺氧诱导因子-1α（HIF- 1α）表达的影响。方法建立小鼠移植S180肉瘤模型。随机分为荷瘤对照组、环磷酰胺（CTX）组、散结抗瘤方组、散结抗瘤方加CTX组（联合组）。连续给药15 d后处死小鼠，计算其抑瘤率,用免疫组化法检测移植瘤VEGF 和HIF- 1α表达。结果荷瘤对照组的肿瘤生长迅速，散结抗瘤方组肿瘤生长受到抑制（P<0.05），联用CTX时抑瘤效果更显著（P<0.01）。与荷瘤对照组比较，给药各组的VEGF、HIF- 1α蛋白的表达均明显降低（P<0.05）。结论散结抗瘤方可以抑制肿瘤生长，且与CTX有协同作用，该方可能通过对HIF- 1α的抑制，达到对VEGF 的表达调控，从而抑制肿瘤生长。
       【关键词】  散结抗瘤方； 荷瘤小鼠； 抑瘤率； 血管内皮生长因子； 缺氧诱导因子-1α
          缺氧是实体肿瘤的常见现象，新生血管体系的形成是肿瘤解决缺氧的重要途径。血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)是目前发现肿瘤诱导产生血管网的最重要的细胞因子之一。缺氧诱导因子-1α（Hypoxia inducible factor -1α，HIF-1α）是缺氧状态下血管生成的核心调控因子，在基因水平上直接调控VEGF的表达，是恶性肿瘤诱导血管形成的重要调控因子。散结抗瘤方是在我们临床实践中总结出来的中药抗癌复方，前期的实验研究证明，该方抑瘤作用可能与其诱导肿瘤细胞凋亡密切相关［1］。本研究旨在观察该方对S180荷瘤小鼠生长的抑制作用和对VEGF和HIF -1α表达的调控，探求该方抑制肿瘤血管生成的可能作用靶点。
       1   材料
       1.1  动物与细胞株 
       SPF级昆明种小鼠40只，雄性，体质量18～22 g，5～6周龄，购于南方医科大学实验动物中心，合格证号：SCXK粤2006-0015；S180细胞株，购于中山大学医学院细胞中心。
       1.2 药品与试剂
       散结抗瘤方由浙贝、法夏、蜈蚣、夏枯草等8味药组成。购于宝芝林大药房。注射用环磷酰胺，0.2 g/支，百特医疗用品有限公司（产品批号：6G521A）。VEGF和HIF-1α一抗、SP免疫组化试剂盒及DAB显色试剂盒均购于北京博奥森生物工程有限公司。
       1.3 仪器
       DK-8AD型电热恒温水浴箱（上海一恒科技有限公司），VT-1300-U超净工作台（苏州安泰空气技术有限公司），L420台式低速自动平衡离心机（长沙湘仪离心机仪器有限公司），P1303电子天平（梅特勒-托利多仪器有限公司）。
       2 方法
       2.1   散结抗瘤方药液的制备 将药物加水浸泡20 min，常规水煎煮2次，所得水煎液经70℃恒温水浴箱蒸发浓缩，最后所得药液浓度为(含生药)1 g/ml。4℃冰箱保存，用时摇匀。
       2.2  S180荷瘤小鼠模型的建立选择腹腔接种瘤细胞1周左右的小鼠颈椎脱臼处死，固定于蜡板上，在超净台内无菌抽取乳白色腹水液，用生理盐水稀释，调整细胞数为2×107/ml，取0.2 ml于每只小鼠右侧腋窝下消毒后皮下接种。瘤细胞悬液接种前，均用0.2%台盼蓝染色，计算活细胞数为95%～98%。从抽取腹水开始，到接种完最后1只小鼠的总时间控制在1h内。
       2.3  分组及给药小鼠接种24h后，按体质量随机分为荷瘤对照组、环磷酰胺组、散结抗瘤方组，散结抗瘤方加环磷酰胺组（联合组）。每组10只。荷瘤对照组给蒸馏水0.5 ml灌胃，生理盐水0.2 ml腹腔注射；环磷酰胺组给蒸馏水0.5 ml灌胃，环磷酰胺20 mg/kg腹腔注射；散结抗瘤方组相应剂量灌胃（根据人与小鼠药物剂量换算公式计算可得），生理盐水0.2 ml腹腔注射；联合组给予散结方药液相应剂量灌胃（计算方法同散结抗瘤方组），环磷酰胺20 mg/kg 腹腔注射。实验过程中每3 d称小鼠体质量1次，根据体质量调整给药量。各组连续给药15 d。
       2.4  肿瘤抑制实验停药次日称重并处死小鼠，解剖剥离瘤块，称重计算均值，计算肿瘤抑制率；同时取出小鼠的脾脏和胸腺，称其重量，计算脾脏、胸腺指数。
        肿瘤抑制百分率(抑瘤)计算:抑瘤率(%)=(荷瘤对照组平均瘤重 -治疗组平均瘤重)/荷瘤对照组平均瘤重×100%
        脾脏指数=脾脏重量（mg）/体质量(g)
        胸腺指数=胸腺重量（mg）/体质量(g)
        按金氏公式求 q值 ,判断两药合用的效果。
       
       q=(EA +B)/ EA+(1-EA)×EB］；EA +B为两药合用时的抑制率；EA为散结抗瘤方单独应用时的抑制率；EB为环磷酰胺单独应用时的抑制率。
        q<0.85表示两药合用有拮抗作用；q>0.85表示两药合用有协同作用；1.15 >q>0.85表示两药合用有相加作用。
       2.5  病理形态观察
       肿瘤组织用 10%中性甲醛固定,梯度酒精脱水，二甲苯透明，石蜡包埋切片,厚度3 μm，HE染色,光镜观察。
       2.6   免疫组化染色
       采用免疫组化SP法。切片常规处理，阴性对照以 PBS代替一抗，严格按试剂盒说明进行免疫组织化学染色。苏木精复染核后，脱水，透明，封片。
        HIF-1α、VEGF表达的测定：HIF-1α、VEGF免疫组化染色阳性细胞为肿瘤细胞胞核或(和)胞质内出现棕色或棕黄色颗粒。免疫组化染色评分按Rahman等［2］标准分为0～4级：阴性为0分，阳性细胞1%～25%为1分，26%～50%为2分，51%～75%为3分，76%～100%为4分。染色强度划分为0～3级：阴性为0分，弱阳性为1分，中等强度为2分，强阳性为3分；两者得分相加为最后得分。
       2.7  疗效评价
       按文献［3］治疗恶性肿瘤药物的疗效评价标准评价：①对照组小鼠肿瘤重量均值不得低于 1 g；②肿瘤抑制率在30%以上，与对照组比较有明显差异；③给药组动物平均体重下降(与自身对照)不得超过 15%；④死亡动物数不超过 20%。
       2.8   统计方法
        
       采用 SPSS13.0统计软件包对数据进行分析处理, 计量资料以±s表示，多个样本均数的比较采用方差分析，相关关系的分析采用Spearman 等级相关分析。P<0.05为差异有统计学意义。
       3   结果
       3.1   小鼠和瘤体的外观表现小鼠接种肿瘤细胞 3 d内，外观无明显变化，活动饮食正常。第 4、5 日后可在皮下触及如米粒样肿块，以后肿瘤逐日增大，荷瘤对照组肿瘤生长较快，并且小鼠饮食减少，毛发杂乱无光泽，竖毛现象明显，活动也明显减少；其他各组肿瘤生长相对缓慢，散结抗瘤方组和联合组小鼠明显比荷瘤对照小鼠活泼，皮毛有光泽，竖毛现象不明显；环磷酰胺组小鼠状况最差。
       
       在剥离瘤块时，发现荷瘤对照组小鼠的瘤块明显增大，有的浸润到胸骨和锁骨，界限不清，不易剥离，有丰富的血管分布；而其余组瘤块体积较小，中央液化坏死较多，且肿瘤组织色白，血管分布减少。
       3.2   实验各组荷瘤小鼠瘤重及抑瘤率接种后，小鼠成瘤率100%。且整个实验过程中小鼠无一例死亡。荷瘤对照组小鼠肿瘤重量均>1 g，说明肿瘤模型移植成功。如表1所示，散结抗瘤方、环磷酰胺组、联合组的瘤重与荷瘤对照组相比差异显著（P<0.05）；单独应用散结抗瘤方和环磷酰胺的抑瘤率分别为30.26%和51.55%。而在相同条件下，联合用药组抑瘤率为71.14%，q值为1.08，表明两药联合应用具有协同作用。表1  各组荷瘤小鼠瘤重及抑瘤率（略）
       3.3   实验各组荷瘤小鼠的胸腺指数及脾脏指数 如表2所示，散结抗瘤方组的胸腺指数、脾脏指数较荷瘤对照组和环磷酰胺组有显著性提高，差别具有统计学意义（P<0.05）；与环磷酰胺组比较，散结抗瘤方组和联合组的胸腺指数和脾脏指数均有显著性提高（P<0.05）。表2  各组荷瘤小鼠的胸腺指数及脾指数情况（略）
       
       3.4   肿瘤组织的病理形态学观察给药组瘤体体积普遍小于对照组。HE染色切片可见：荷瘤对照组肿瘤组织呈巢状或片状生长，并侵犯肌肉及神经组织，肿瘤细胞排列较密集，核分裂相较多；瘤细胞异型性较明显，核质比较大；瘤组织内小血管较丰富。各给药组均可见不同程度的片状坏死区，瘤细胞密度变小，异型性降低，病理性核分裂较少；瘤组织及其周围新生微血管减少，结缔组织增多；间质较多的以淋巴细胞、巨噬细胞为主的细胞浸润。其中以联合组最为显著。
       3.5   各组小鼠S180组织中VEGF和HIF-1α蛋白的表达 免疫组化的结果显示，VEGF阳性染色主要为胞浆呈棕黄色颗粒状着色；HIF-1α阳性染色除定位于胞浆外，少量胞核也有着色。各组小鼠肿瘤组织中均有VEGF和HIF-1α蛋白的表达，但是表达程度不同，与荷瘤对照组相比，给药各组对二者的表达均有不同程度的抑制作用。其中联合组的抑制作用最强。表3  小鼠S180肉瘤组织VEGF、HIF-1α蛋白表达（略）
       3.6   HIF-1α与VEGF 表达的相关性Spearman 等级相关分析结果显示, HIF-1α的表达与VEGF 表达之间呈正相关( r=0.806,P<0.01) 。
       4   讨论
        癌病是多种恶性肿瘤的总称，祖国医学认为，癌病的发生是在脏腑阴阳气血失调的基础上，六淫邪毒入侵，并与气、痰、湿、瘀、热等搏结积聚而成［4］。中药治疗肿瘤有多种不同的治则［5］。散结抗瘤方以攻邪为主要目的，药物为法夏、浙贝母、蜈蚣、夏枯草等8味，关于这类药的抗肿瘤作用已有很多文献报道［6～10］。本实验以S180移植性肉瘤小鼠为研究对象，发现散结抗瘤方组的抑瘤率为30.26%，平均瘤重低于对照组（P<0.05）；与化疗药物环磷酰胺联合应用时抑瘤率可达到71.14%，说明散结抗瘤方确有抗肿瘤的疗效，且其联合环磷酰胺在抑制肿瘤生长方面有协同作用。同时，散结抗瘤方还能保护小鼠的胸腺和脾脏，提高小鼠的免疫功能，减少环磷酰胺组小鼠受化疗药的毒副作用影响,有利于荷瘤机体的治疗。
        在恶性肿瘤的病理中，细胞对低氧的适应和血管生成是肿瘤发展过程中的关键步骤之一。HIF-1α是广泛存在于哺乳动物和人体内的一种转录因子，是主要的氧调节亚基和功能亚基，在肿瘤的氧反应过程中HIF-1α起着中枢纽带的作用。VEGF作为一种诱导血管形成的血管生长因子,在血管生成过程中起核心作用。国内外研究表明,VEGF通过旁分泌和自分泌机制从而促血管生成、促进肿瘤细胞生长浸润和转移［11］，其在大多数肿瘤细胞内呈高表达。已有的研究表明，随着肿瘤体积的不断快速增大，肿瘤便进入了缺氧状态，从而使大量HIF - 1α积聚。增多的HIF - 1α就会与其下游携带有低氧反应元件（HRE）特异区域的靶基因结合使其表达增强，其中VEGF就是其靶基因中最重要的一种因子。还有资料报道，HIF - 1α还可增加缺氧情况下的VEGF的稳定性［12］。本实验结果显示：散结抗瘤方组的HIF-1α和VEGF蛋白表达均显著低于荷瘤对照组，其中联合组的抑制作用最强；而且HIF-1α和VEGF之间正相关（r=0.806 ,P<0.01）。由此提示H IF-1α可能参与了散结抗瘤方的抗血管生成，通过下调肿瘤细胞中HIF-1α蛋白表达，进而抑制其下游靶基因VEGF的蛋白表达，可能是该复方抗血管生成的重要机制。实验结果同时也提示，当其联合化疗药应用时对HIF-1α和VEGF蛋白的表达下调作用更加明显。
        总之，散结抗瘤方具有抗肿瘤和抑制肿瘤血管形成的作用，其机制可能与下调VEGF和HIF-1α的表达有关。由于中药的组成比较复杂，其抗肿瘤作用是多靶点、多通道的，对于该方的作用机制仍然有待进一步研究。
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