商陆药材中商陆皂苷甲的含量测定
作者：王瑞，李文艳，赵森淼，侴桂新，王峥涛
作者单位：1.上海中医药大学中药学院·教育部中药标准化重点实验室，上海 201203；2.上海中药标准化研究中心，上海 201203；3.上海市浦东新区公利医院，上海 200135
《时珍国医国药》 2010年 第5期
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【摘要】
目的建立商陆药材中商陆皂苷甲的高效液相色谱（HPLC）分析方法。方法采用Ultimate AQ-C18（4.6 mm × 250 mm，5 μm）色谱柱，以乙腈-0.02%磷酸（32∶68）为流动相，流速1.0 ml/min，检测波长203 nm，柱温30℃。结果商陆皂苷甲在1.0～7.0 μg呈良好的线性关系，r=0.999 9，平均回收率为99.1 %（RSD=2.7 %）。8批不同产地商陆药材中商陆皂苷甲的质量分数在0.25 %～0.62 %。结论方法简单、重复性好，可用于商陆药材的质量控制。
【关键词】 商陆； 陆皂苷甲； 高效液相色谱法
Determination of Esculentoside A in Radix Phytolaccae by HPLC
WANG Rui，LI Wenyan，ZHAO Senmiao，CHOU Guixin， WANG Zhengtao
1.Shanghai University of Traditional Chinese Medicines, Shanghai 201203, China; 2. Shanghai R&D Center for Standardization of Traditional Chinese Medicines, Shanghai 201203, China; 3. Pharmacological Department of Gongli Hospital of Pudong New Area, Shanghai 200135, China
Abstract：ObjectiveTo develop a quantitative method for determination of esculentoside A in Radix Phytolaccae. MethodsThe samples were separated at 30℃ on a Ultimate AQ-C18 (5 μm，4.6 mm×250 mm) column eluted with acetonitrile-0.02% phosphoric acid (32∶68) as the mobile phase. Flow rate was set at 1.0 ml/min and the detection wavelength was set at 203 nm.ResultsThe calibration curve was linear within the range of 1.0 to 7.0 μg (r=0. 999 9) and the average recovery was 99.1 % (RSD=2.8 %). 8 batches of the drugs purchased from different areas were determined and the contents of esculentoside A in Radix Phytolaccae were fluctuated from 0. 25 % to 0.62 %. Conclusion The method is simple, repeatable and can be used for the quality control of Radix Phytolaccae.
Key words：Radix Phytolaccae; Esculentoside A; HPLC
商陆（Radix Phytolaccae）为商陆科植物商陆Phytolacca acinosa Roxb.或垂序商陆Phytolacca americana L.的干燥根，具有逐水消肿、通利二便、解毒散结之功效［1］。商陆中主要含有商陆皂苷活性成分，具有抗炎、免疫增强、抗肿瘤等多种药理作用，其中以商陆皂苷甲含量最高［2，3］。现行《中国药典》标准中商陆项下仅见药材性状和显微鉴别，无专属性指标成分用于该药材的质量控制。商陆皂苷甲的含量测定方法文献报道较少，仅见双波长薄层扫描法和高效液相色谱法（HPLC-ELSD）［4，5］，但效果不佳。因此，本文建立了商陆中商陆皂苷甲的HPLC-UV含量测定方法，并对不同产地样品进行测定。
1 仪器与试药
高效液相色谱仪（日本岛津公司，包括四元泵、自动进样器、柱温箱、二极管阵列检测器、工作站）；乙腈（色谱纯，德国Merck公司）；水（纯净水）；其它试剂均为分析纯（国药集团化学试剂有限公司）。商陆皂苷甲对照品由上海中药标准化研究中心制备（纯度>98%）。
实验所用商陆药材由上海中药标准化研究中心吴立宏副研究员收集并鉴定，标本保存在上海中药标准化研究中心。
2 方法与结果
2.1 色谱条件Ultimate AQ-C18色谱柱（4.6 mm × 250 mm，5 μm）；流动相为乙腈－0.02%磷酸（32∶68）；检测波长203 nm；流速1.0 ml/min；柱温30℃；进样量20 μl。理论板数按商陆皂苷甲峰计算应不低于3 000。对照品和样品的HPLC图见图1。
2.2 对照品溶液的制备取商陆皂苷甲对照品适量，精密称定，加甲醇制成每毫升含150 μg的溶液，即得。
2.3 供试品溶液的制备取样品粉末（过3号筛）约1 g，精密称定，置圆底烧瓶中，精密加80%甲醇20 ml，称定重量，加热回流1 h，放冷，再称定重量，用80%甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
2.4 线性关系考察取商陆皂苷甲对照品适量，精密称定，加甲醇溶解并稀释至刻度，制成0.200 6 mg/ml的对照品溶液，按上述色谱条件测定，分别进样5，10，15，20，25，30，35 μl，以对照品含量（X）为横坐标，峰面积（Y）为纵坐标，得回归方程为Y =633 210 X +1 828.3，r=0.999 9，商陆皂苷甲在1.0 ～7.0 μg呈良好的线性关系。
2.5 检测限和定量限取对照品溶液，用甲醇依次稀释制成系列浓度由高到低的溶液，测得商陆皂苷甲的检测限（S/N=3）为10.0 ng，定量限（S/N=10）为24.1 ng（RSD=2.2%）。
2.6 精密度实验取同一供试品溶液，在上述色谱条件下连续进样6次，测得商陆皂苷甲色谱峰面积的RSD为0.4 %，仪器精密度良好。
2.7 重复性实验取同一样品粉末6份，精密称定，按“2.3”项下操作，在上述色谱条件下进样测定，测得商陆皂苷甲色谱峰面积并计算含量，RSD为0.9 %。
2.8 稳定性实验取样品粉末约1 g，精密称定，按“2.3”项下操作，在上述色谱条件下，分别于0，1，2，4，8，12，24，36，48，72 h进样分析，测得商陆皂苷甲色谱峰面积的RSD为0.9 %，表明供试品溶液在72 h内稳定。
2.9 回收率实验取已知含量的商陆样品9份约0.5 g，精密称定，分别按已知量的50%、100%和150%3个水平加入商陆皂苷甲对照品，按“2.3”项下操作，在上述色谱条件下进样测定。结果见表1。表1 商陆皂苷甲加样回收率实验结果（略）
2.10 样品测定分别取商陆样品粉末约1 g，精密称定，按“2.3”项下操作，制成供试品溶液。分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各20 μl进样分析，按干燥品计算商陆皂苷甲（C42H66O16）的含量。结果见表2。表2 不同产地商陆中商陆皂苷甲的含量测定结果（略）
3 讨论
本研究建立了商陆中商陆皂苷甲的HPLC-UV含量测定法，并测定了8批不同产地样品的含量。不同批次商陆中商陆皂苷甲的质量分数在0.25 %～0.62 %，均值0.35 %，差异较大，有必要对其进行质量控制。本方法简便，专属性强，重复性好，可用于商陆的质量控制，为商陆质量标准的完善奠定了基础。
在供试品溶液制备方法上，对提取溶剂（乙醇，80%乙醇，50%乙醇，甲醇，80%甲醇，50%甲醇）、提取方法（冷浸，超声振荡，直接回流）、提取时间（30，60，90 min）和提取溶剂量（20，40，60倍）进行考察，最终确定提取方法为1 g 样品加80%甲醇20 ml加热回流1h。
耐受性试验中，对不同色谱柱（Shiseido C18 MG，Ultimate XB-C18，Ultimate AQ-C18；5 μm，4.6 mm×250 mm）进行考察，结果均符合含量测定要求，耐受性良好。
【参考文献】
［1］国家药典委员会. 中国药典，Ⅰ部［S］. 北京：化学工业出版社，2005：227.
［2］黄康泰. 常用中药成分与药理手册［S］. 北京：中国医药科技出版社，1994：1612.
［3］贾金萍，秦雪梅，李青山. 商陆化学成分和药理作用的研究进展［J］. 山西医科大学学报，2003，34（1）：89.
［4］范大钧，安登奎，李修禄，等. 双波长薄层扫描法测定商陆及制剂中商陆皂甙甲的含量［J］. 药物分析杂志，1994，14（6）：44.
［5］邢 浩，庞 雷. 高效液相色谱法测定商陆植物中皂甙甲的含量［J］. 中日友好医院学报，2004，18（5）：304.