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       【摘要】 
       目的研究蹄叶橐吾乙醇提取物对大鼠和小鼠肝细胞色素P450（CYP450）的影响。方法蹄叶橐吾乙醇提取物口服给药后，观察其对小鼠戊巴比妥钠催眠作用的影响、对大鼠肝微粒体CYP450含量、肝脏指数的影响，采用HPLC测定探针药的代谢率观察其对大鼠肝CYP450的7种亚型酶活性的影响。结果蹄叶橐吾乙醇提取物对戊巴比妥钠诱导小鼠的睡眠时间无影响，大鼠肝CYP450含量及肝脏指数无显著变化，对大鼠肝CYP450的7种亚型探针药的代谢率亦无影响。结论蹄叶橐吾乙醇提取物对肝药酶无诱导作用。
       【关键词】  蹄叶橐吾； 肝细胞色素P450； 诱导作用
        细胞色素P450（cytochrome P450, CYP450）是生物体内参与各类外源性及内源性物质代谢的主要酶系，负责90%以上药物的生物转化。CYP450的活性可受到多种因素的影响。近年来，由于药物代谢性相互作用诱发的不良反应日渐引起人们的重视。但有关中草药对CYP450影响作用的报道尚不多见。蹄叶橐吾（Ligularia fischeri） 为菊科（Compasitae）橐吾属(Ligularia)多年生草本植物，又名肾叶橐吾（《中药志》）、马蹄叶（东北）等，其根和根茎收入吉林省药材标准，名山紫菀［1］。药理研究表明，其根和根茎具有镇咳祛痰作用［2］，叶的提取物具有抗氧化作用［3，4］，地上部分乙醇提取物具有抗炎免疫［5，6］和抗溃疡作用［7］。且蹄叶橐吾的安全性较高［8，9］。本实验通过研究蹄叶橐吾地上部分乙醇提取物对肝CYP450的影响，预测其在联合用药时可能会产生的代谢性相互作用，对蹄叶橐吾临床合理用药提供科学依据。
       1  材料与仪器
       1.1  药品蹄叶橐吾（野生）在吉林省珲春市采集，由延边大学药学院刘永镇教授鉴定。蹄叶橐吾地上部分乙醇提取物（ethanol extract from Ligularia fischeri，以下简写为Lfe）的制备：蹄叶橐吾地上部分晾干、粉碎，用95%乙醇加热回流提取，滤液加水放置24 h，过滤后用石油醚萃取，水层加热浓缩至浸膏，每克相当于20 g生药，实验用其水溶液灌胃给药。
       1.2  试剂非那西汀（phenacetin），双氯酚酸（Diclofenac），奥美拉唑（Omeprazole），氢溴酸右美沙芬（Dextromethorphan Hydrobromide），氯唑沙宗（Chlorzoxazone），氨苯砜（Dapsone, aminophenylsulfone）均购于中国药品生物制品检定所, 香豆素（Coumarin）购于沈阳市试剂三厂（化学纯）。葡萄糖-6-磷酸（D-Glucose 6-phosphate disodium salt hydrate）、氧化型辅酶Ⅱ (β-Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate sodium salt hydrate , β-NADP)和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(Glucose-6-phosphate Dehydrogenase) 购于sigma公司。戊巴比妥钠，Serva进口分装（上海化学试剂分装厂）。HPLC级甲醇、乙腈购于美国Fisher公司。
       1.3  仪器美国Thermo Finnigan surveyor高效液相色谱仪（配有四元泵、自动进样器、二极管阵列检测器）；Xcalibur 1.4色谱工作站；Agilent XDB-C18色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；日本岛津Shimadzu UV-260紫外可见光分光光度计；MQX-200酶标仪（美国Bio-Tek Instruments Inc.）；EYELA旋转蒸发仪（N-1000 SD-2000）；BECKMAN公司高速冷冻离心机；2K-15型高速离心机(Sigma)；YKH-3型液体快速混合器（江西医疗器械厂）；瑞士METLER TOLEDO公司AG135型电子天平。
       1.4  动物昆明种雄性小鼠，体质量（20 ±2） g；Wistar雄性大鼠，体质量（210±10） g。购于北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证编号：SCXK（京）2006-0009。
       2  方法
       2.1  Lfe对小鼠戊巴比妥钠催眠作用的影响小鼠随机分为两组，每组10只。药物组灌胃(ig)给予Lfe 250 mg· kg-1，对照组ig同体积生理盐水，1次/d，连续3 d。末次给药后24 h各组小鼠均腹腔注射(ip)戊巴比妥钠 50 mg·kg -1。室温22～25℃，ip戊巴比妥钠的时间在上午9时左右。观察小鼠的睡眠时间(从翻正反射消失至恢复的间隔时间)。
       2.2  Lfe对大鼠CYP450含量及各亚型酶活性的影响大鼠随机分为2组，每组8只。药物组灌胃给予Lfe 250 mg· kg-1，对照组ig同体积生理盐水，1次/d，连续3 d。
       2.2.1  大鼠肝微粒体的制备末次给药后24 h将大鼠处死，采用差速离心法制备肝微粒体。取肝脏，漂洗、吸干、称重后剪碎，按1∶3(W/V)比例加入TMS缓冲液（含0.05mol·L-1 Tris，3 mmol·L-1 MgCl2，0.2 mol·L-1蔗糖，pH 7.4）匀浆后于4℃，10 000 g，离心30 min，取上清液转移至超速离心管内，4 ℃离心，100 000 g，60 min，沉淀即为肝微粒体。重悬后分装，置-80℃ 冰箱内保存备用。微粒体蛋白浓度采用Bradford法测定［10］。
       2.2.2  CYP450含量及肝脏指数的测定采用Omura和Sato的方法测定CYP450含量［11］。P450(nmol·mg-1蛋白) =［Δ A ( 450 nm - 490 nm)×1000］/91×蛋白浓度（mg·ml-1）。计算肝脏指数，肝脏指数（g/100g体质量）=（肝重/体质量）×100%。
       2.2.3  肝微粒体体外温孵实验将Lfe给药组8只大鼠的微粒体蛋白稀释至相同浓度后等体积混合，分装至各管。对照组大鼠微粒体亦作相同处理。将探针药香豆素（CYP2A6底物）、右美沙芬（CYP2D6底物）、双氯酚酸（CYP2C9底物）、奥美拉唑（CYP2C19底物）、氨苯砜（CYP3A4底物）、非那西汀（CYP1A2底物）、氯唑沙宗（CYP2E1底物）分别与给药组或对照组大鼠的肝微粒体于37℃温孵。以pH 7.4的Tris-Hcl缓冲液0.5 ml为总反应体系，其中肝微粒体蛋白浓度1 mg·ml-1，NADPH 生成系统(NADP 1 mmol·L-1,葡萄糖-6-磷酸10 mmol·L-1，葡萄糖-6-磷酸脱氢酶1U·ml-1)，MgCl2  4 mmol·L-1。探针药浓度及温孵时间见表1。反应体系中有机溶剂终浓度不超过0.5%（V/V）。表1  各探针药浓度、温孵时间及色谱条件(略)
       2.2.4  肝微粒体温孵样品的处理及HPLC测定各反应管温孵一定时间后加入3 mL 甲醇终止反应，涡旋振荡1 min，离心，取上清3 mL，35℃减压蒸干，残渣用100 μl流动相复溶，离心10 000 r·min-1，10 min，取上清，进样20 μl。应用HPLC测定上述探针药的代谢率，与对照组比较，以反映Lfe对上述CYP450各亚型是否有诱导作用。其中氨苯砜，非那西汀，氯唑沙宗的测定采用“鸡尾酒”(cocktail）法。
       2.3  统计处理实验结果以±s表示，采用SPSS 13.0统计软件进行方差分析。
       3  结果
       3.1  Lfe对戊巴比妥钠诱导小鼠睡眠时间的影响与对照组相比，Lfe连续给药3 d，戊巴比妥钠诱导小鼠的睡眠时间无显著性差异（P>0.05），表明Lfe对小鼠肝药酶无诱导作用。结果见表2。表2  Lfe对戊巴比妥钠诱导小鼠睡眠时间的影响(略)
       3.2  Lfe对大鼠肝CYP450含量及肝脏指数的影响结果显示，Lfe连续给药3 d后，大鼠CYP450含量及肝脏指数与对照组相比均无显著性差异(P>0.05), 表明Lfe对大鼠CYP450无诱导作用。结果见表3。表3  Lfe对大鼠肝CYP450含量及肝脏指数的影响(略)
       3.3  Lfe对大鼠CYP450各亚型酶活性的影响
       3.3.1  色谱行为如图1所示，在选定的HPLC条件下各探针药峰形较好，肝微粒体内源性物质对其测定无干扰，可作为各探针药定量分析的条件。
       3.3.2  各探针药代谢率的测定结果结果表明，Lfe口服给药3次后CYP1A2, 2C9, 2C19, 2D6, 2E1, 3A4, 2A6等7种CYP450亚型特异性底物的代谢率与对照组相比均无显著性差异，表明Lfe对上述7种CYP450亚型酶无诱导作用。结果见图2。与表3结果-Lfe对CYP450含量及肝脏指数无明显影响相一致。
       4  讨论
          
       药物相互作用最常见的原因是CYP450的诱导和抑制。药酶的诱导可增加生物转化率，从而降低药物浓度，使药效减弱，如果代谢形成活性产物则会增强药物的作用或毒性。在药物代谢性相互作用中，酶诱导引起的相互作用约占23%，因此揭示蹄叶橐吾地上部分乙醇提取物（Lfe）对肝CYP 450的影响对于其临床合理用药具有重要意义。
        为了解Lfe是否存在潜在的代谢性相互作用，本实验观察了Lfe对药物代谢酶CYP450的影响。戊巴比妥钠由肝脏代谢，其诱导小鼠睡眠时间的长短可反映肝药酶的活性。以戊巴比妥钠诱导小鼠的睡眠时间作为观测肝药酶体内活性变化的生物学指标，并利用整体动物多次给予Lfe后肝微粒体CYP450含量、肝脏指数、肝CYP450酶活性的变化观察其对CYP450酶是否有诱导作用。
       
       Lfe 250 mg· kg-1连续给药3 d，对戊巴比妥钠诱导小鼠的睡眠时间无影响，间接提示Lfe对小鼠肝药酶无诱导作用。Lfe 250 mg· kg-1连续给药3 d后，大鼠肝CYP450总量和肝脏指数无显著变化，提示Lfe对大鼠肝药酶无诱导作用。但上述作用是否系Lfe对CYP450多种亚型酶诱导和抑制作用的综合结果尚不能确定。因此，我们进一步研究了Lfe对CYP450多种亚型酶活性的影响，主要是7种参与临床常用药物代谢的CYP450同工酶。研究结果显示，大鼠连续口服Lfe后的肝微粒体对CYP1A2，2C9，2C19，2D6，2E1，3A4，2A6等7种亚型酶的特异性探针药的代谢率均无影响，表明Lfe对上述7种CYP450亚型酶活性均无明显影响。综合上述结果，Lfe对肝药酶无诱导作用。提示在将来临床试用时与同服的其他药物可能不致会因肝药酶的诱导作用而影响有关药物的药效或毒性。关于Lfe对肝CYP450是否具有抑制作用尚需进一步实验证实。
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