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       【摘要】 
       目的从天山堇菜中提取总黄酮和多糖，并测定其含量。方法运用微波技术提取天山堇菜总黄酮和多糖，用比色法测定总黄酮和多糖含量。结果测得天山堇菜中总黄酮含量为1.465％，平均回收率为98.05％，RSD为1.74％(n=5)；多糖含量为8.478％，平均回收率为99.86％，RSD为1.58％(n=5)。结论运用微波技术从天山堇菜中提取总黄酮和多糖，反应速度快，效率高。
       【关键词】  微波技术； 天山堇菜； 总黄酮； 多糖； 提取
       Microwave Extraction and Determination of Total Flavonoids and Polysaccharides in Viola tianshanica Maxim
       WU Jianfang, LI Bingqi, XUE Mei, WEI Wenzhen
       1. College of Life Sciences, Shihezi Unviersity, Shihezi 832003, China; 2. Chemistry and Chemical Engineering College, Shihezi University, Shihezi 832003, China
       Abstract：ObjectiveTo extract and determine the total flavonoids and polysaccharides in Viola tianshanica Maxim.MethodsTotal flavonoids and polysaccharides in Viola tianshanica Maxim were extracted by microwave technique and determined by colorimetry. ResultsTotal flavonoids in Viola tianshanica Maxim was 0.440%，the recovery rate was 98.05%， and RSD was 1.74％ (n=5); polysaccharides in Viola tianshanica Maxim was 8.478％，the recovery rate was 99.86％，RSD was 1.58% (n=5).ConclusionMicrowave technique was applied to extract total flavonoids and polysaccharides in  Viola tianshanica Maxim for the first time.The reaction speed is fast and the result is satisfactory.
       Key words：Microwave technique;  Viola tianshanica Maxim;  Total flavonoids;   Polysaccharide;  Extraction;  Determination
        天山堇菜，维药名为比那夫西(Herba Violae Tianshanicae)是堇菜Violaceae植物天山堇菜Viola tianshanica Maxim的干燥全草。其气微，味微苦辛、性凉，清热解毒，具有调理、软化、发汗的作用［1］。天山堇菜主要分布于新疆南疆各山区，前苏联亦有分布。其药用部位是全草，全草经预实验检出含挥发油、黄酮类、生物碱、氨基酸、液质皂苷、鞣质等［2］，天山堇菜作为维吾尔族药在新疆民间被广泛应用， 但有关其化学成分多糖和黄酮的研究，至今未见报道。微波法原理是利用磁控管所产生的24.5 亿次/s 超高频率的快速震动， 使材料内分子间相互碰撞、挤压，利于有效成分的浸出。与传统的中药煎煮法相比，微波加热法可以得到更高的产物提取率，而且整个过程大大缩短提取时间，杂质含量显著减少［3］。 我们运用微波技术联合提取天山堇菜中总黄酮和多糖， 以芦丁为对照品测定天山堇菜中总黄酮含量，加入铝离子试剂，同时控制适宜pH值，使黄酮化合物与铝盐形成配合物在可见光区能获得稳定的特征吸收峰；运用微波技术水提醇沉法制得天山堇菜粗多糖，并采用酚-硫酸比色法对其多糖进行含量测定，以期为天山堇菜总黄酮和多糖的研究和开发利用奠定基础。
       1  材料与设备
        对照品芦丁，购自中国药品生物制品检定所；其余试剂均为分析纯；天山堇菜，购自新疆和田市维吾尔医院。722型分光光度计，日本岛津； MCL-3型连续微波反应器，四川大学无线电系。
       2 方法与结果
       2.1  样品溶液制备
       取天山堇菜约2 g，精密称定，用滤纸包好，分置于索氏提取器中，用石油醚（60～90℃）水浴回流脱脂2次（2 h/次），弃去石油醚提取液。天山堇菜挥干石油醚后，置1 000 ml烧瓶中，将此烧瓶放入MCL-3型连续微波反应器中，用80%乙醇回流提取两次，调整功率560，500，400，350 W，每次反应时间20 min，提尽黄酮。另用少量80%乙醇多次洗涤天山堇菜，并入提取液中，定量转移入100 ml容量瓶中，加80%乙醇至刻度，摇匀，即得测总黄酮之天山堇菜样品液。
       
       将提尽黄酮后的天山堇菜置100 ml烧瓶中，放入MCL-3型连续微波反应器中，用80%乙醇回流提取20 min，调整功率560，500，400，350 W，以除去单糖及一些苷类，弃提取液。天山堇菜挥干乙醇后，再放入MCL-3型连续微波反应器中，继续以水回流提取2次（20 min/次），调整功率560，500，400，350 W，减压抽滤，各次滤液合并。水浴浓缩后，用蒸馏水定容至250 ml，即为测多糖的天山堇菜样品液。
       2.2 总黄酮含量的测定
       2.2.1  标准曲线制备
       精密称取芦丁对照品10 mg，置25 ml量瓶中，加80%乙醇溶解，定容，精密吸取0.0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 ml，分置于10 ml量瓶中，加5%亚硝酸钠0.3 ml，放置6min，再加10%硝酸铝0.3 ml，放置6 min，加4%氢氧化钠4 ml，加水至刻度，摇匀。进行全波长扫描在510 nm 处均有最大吸收。以510 nm处测得的吸收度A对浓度C回归，得回归方程：A=11.225C+0.002 7，r=0.999 13，在8～40 μg/ml的范围内，浓度与吸收度有良好的线性关系。
       2.2.2 样品测定
       分别将测总黄酮的各样品液定量稀释后，再精密吸取各稀释液适量于10 ml量瓶中，照标准曲线制定项下方法操作，测定吸收度，由回归方程求出稀释液中总黄酮浓度，然后计算百分含量。结果见表1。
       2.2.3 精密度实验分别量取黄酮样品液适量按“2.2.1”项下的操作，对同一样品液连续测定5次。结果RSD＝1.02%（n=5），表明本实验精密性良好。
       2.2.4 重复性实验
       精密称取同批天山堇菜样品共5份，按“2.1”项下方法操作，制备黄酮样品济液5份，进行含量测定。RSD=1.42（n=5），结果表明本方法重复性良好。
       2.2.5  稳定性实验
       按“2.2.2”项下方法操作，测定同一供试液在不同时间的吸收度。结果表明，吸收度值在9 h内基本保持不变。
       2.2.6  回收率实验
       取已知总黄酮含量的供试品溶液1.0 ml于100 ml容量瓶中，再加入0.2mg/ ml的芦丁对照品溶液0.5 ml依法测定，结果平均回收率为98.05%，RSD＝1.74%（n=5）。
       2.3 多糖含量测定
       2.3.1  标准葡萄糖溶液的配制精密称取干燥恒重的葡萄糖25.2 mg，加适量水溶解，转移至250 ml容量瓶中，加水至刻度，摇匀，配成浓度为100.08 μg/ml标准葡萄糖溶液备用。
       2.3.2  5%苯酚试剂的配制取苯酚100 g，加铝片0.1 g和碳酸氢钠0.05 g，蒸馏。收集182℃馏分，称取7.5 g，加水150 ml溶解，置棕色瓶内放冰箱备用。
       2.3.3   标准曲线制备精密量取100.08 μg/ml标准葡萄糖溶液 0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.7 ml置于干燥试管中，分别加水使成1.0 ml，再分别加入5%苯酚溶液1.6 ml摇匀，然后加浓硫酸7.0 ml，充分摇匀，室温放置25 min，在 540 nm处测定其最大吸收度，同时做一空白，结果浓度在10.05～75.5 μg/ml范围内呈线形关系，实验数据做回归处理得回归方程：A=0.069 1C+0.000 3，r=0.999 05。
       2.3.4   换算因素测定称取天山堇菜30 g，置于烧瓶中，将此烧瓶放入MCL-3型连续微波反应器中，依次用250 ml 石油醚(60～90℃)、乙醚和80%乙醇回流提取两次，调整功率560，500，400，350 W，反应时间20 min。减压抽滤，残渣挥干溶剂后，再放入MCL-3型连续微波反应器中，调整功率560，500，400，350 W，继续以水回流提取两次，20 min/次，减压过滤，合并滤液。将滤液减压浓缩至一半体积，加入0.1%活性炭，脱色两次，过滤，滤液加5倍量95%乙醇，放置过夜，抽滤后的沉淀以100 ml水溶解，重复醇沉1次。过滤，残渣用乙醚、无水乙醇反复洗涤，干燥，即得多糖。精确称取60℃干燥恒重的多糖20 mg，水溶解后定容到100 ml容量瓶中，摇匀，作为多糖储备液。精确量取多糖储备液0.2 ml，加水至1 ml，按测定标准曲线同样的方法测其吸收度。按下式计算换算因素：f=W/CD。
       
       式中：W为多糖重量(μg)，C为多糖液中葡萄糖的浓度(μg/ml)，D为多糖的稀释因素，测得f=2.24。
       2.3.5 样品含量测定精确吸取样品液1 ml，按标准曲线制备项下方法测定其吸收度值，按下式计算多糖含量，多糖含量（%）=CDf/W×100% (C为样品溶液的葡萄糖的质量，D为样品溶液的稀释倍数，f为换算因素）。结果见表1。表1  天山堇菜中总黄酮和多糖含量测定（略）
       2.3.6   精密度实验分别量取多糖样品液1 ml按“2.2.1”项下的操作，对同一样品液连续测定5次。结果表明，采用苯酚－硫酸法测定样品，RSD＝0.98％（n=5）精密性良好。
       2.3.7  重复性实验精密称取同批天山堇菜样品共5份，按“2.1”项下方法操作，制备多糖样品济液5份，进行含量测定。RSD =1.42（n=5），结果表明本方法重复性良好。
       2.3.8  稳定性实验用硫酸-苯酚法测定同一样品液在不同时间的吸收度，吸收度值至少在36 h内不变。
       2.3.9  回收率测定精密称取天山堇菜适量，加入精制天山堇菜多糖适量，按“2.1”和“2.3.5”操作，测得多糖平均回收率为99.86%，RSD=1.58%（n=5）。
       3 讨论
        黄酮类化合物是植物次生代谢产物，广泛地存在于自然植物中，表现出多种多样的药理活性，能防治心脑血管系统的疾病和呼吸系统的疾病，具有抗炎抑菌、降血糖、抗氧化、抗辐射、抗癌、抗肿瘤以及增强免疫能力等药理作用［4］。多糖是生物体内普遍存在的一类生物大分子，具有许多重要的生物活性，如参与细胞骨架的构成，作为多种内源性生物活性分子的组成成分等［5］。我们运用微波技术首次提取了天山堇菜中的黄酮和多糖，并对其进行含量测定。结果显示，天山堇菜中黄酮含量为1.465％，含量较少；多糖含量较高为8.478％，具有较高的开发利用价值。本课题对天山堇菜的多糖和黄酮进行含量测定，为其活性成分的研究和资源开发利用提供依据。天山堇菜多糖和黄酮的结构组成和药理活性有待进一步研究。
       【参考文献】
         　　［1］中华人民共和国卫生部药典委员会.中华人民共和国卫生部药品标准·维吾尔药分册［S］.乌鲁木齐:新疆科技卫生出版社，1999.
       
       ［2］刘勇民.维吾尔药志，上册［M］.乌鲁木齐:新疆科技卫生出版社，1999:35.
       
       ［3］张代佳，刘传斌，修志龙，等.微波技术在植物胞内有效成分提取中的应用［J］.中草药，2000，31(9)：附5.
       
       ［4］曹纬国，刘志勤，邵 云，等.黄酮类化合物药理作用的研究进展［J］.西北植物学报，2003，23(12):2241.
       
       ［5］郭新华，佟建明，章世元，等.中药多糖的免疫调节作用及机制的研究进展［J］.广东饲料，2007，16(6):24.