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       【摘要】 
       目的探讨硒化壳聚糖对人早幼粒白血病细胞增殖及凋亡的影响。方法应用SRB法和集落形成法检测硒化壳聚糖对人早幼粒白血病细胞增殖的抑制作用；应用流式细胞法检测药物对细胞的促凋亡作用；应用Western blot法检测WTI蛋白表达的情况。结果25，50，100 mg/L硒化壳聚糖作用HL60细胞48h对细胞有增殖抑制作用（P<0.01）；50，100 mg/L硒化壳聚糖作用细胞48 h后，G0/G1期细胞数较对照组增加了14.9%和22.0%（P<0.05），S期细胞减少了14.3%和20.1%（P<0.05），凋亡率分别是（6.7±1.6）和（11.8±2.1）；50，100 mg/L硒化壳聚糖作用HL60细胞48 h后WTI蛋白表达分别下调38.2%（P<0.05）和64.3%（P<0.01）。结论硒化壳聚糖具有对人早幼粒白血病细胞增殖抑制及促凋亡作用，WTI在此过程中可能发挥着重要的作用。
       【关键词】  硒化壳聚糖； 早幼粒白血病； 凋亡
        壳聚糖［β(1,4)-2-氨基-2-去氧-D-葡萄糖］是存在于自然界中的一种碱性生物多糖，在酸性条件下带正电，与肿瘤细胞表面的阴离子可以通过吸附放电进行中和，抵制其生长，具有抗肿瘤、抗炎、抗菌等多种生物活性［1］，且生物相容性良好，几乎无毒性，没有其它不良反应，在现代药物制备中经常作为良好的药物材料进行开发，拓展其应用范围, 硒化壳聚糖［2］是将壳聚糖与亚硒酸在酸性条件下，以混合金属离子为催化剂，通过拼合原理制备而成的一种有机硒，可有效克服无机硒不易被细胞吸收，活性和毒性范围较窄，致死量相对较小等缺点［3］。目前正对其抗肿瘤作用进行研究。硒和砷属同族，而三氧化二砷在临床上早已做为一种抗早幼粒白血病药物使用，故硒化壳聚糖也应具有抗早幼粒白血病的作用，且毒副作用应该比无机硒和砷小得多。本实验以人早幼粒白血病细胞株HL60为靶细胞，观察了硒化壳聚糖对其产生的诱导凋亡作用并探讨了可能的作用机理，为硒化壳聚糖用于治疗人早幼粒白血病奠定基础。
       1  材料与仪器
       1.1  试药试剂硒化壳聚糖（批号：100601-200518）由本院自制，含硒量为0.4%；Western blot试剂盒为Promega产品；WTI抗体为Santa Cruz产品；甲基纤维素（CPS4000）、磺酰罗丹明B（SRB）、碘化丙锭(ＰＩ)为sigma产品。
       1.2 仪器倒置相差显微镜（日本OLYMPUS公司）；Mod 550型全自动酶标仪（美国Bio-Rad公司）；Epics Elite ESP型流式细胞仪（美国Coulter公司）。
       1.3  细胞人早幼粒白血病细胞株HL60引自福建省血液病研究所。
       2  方法
       2.1  细胞培养HL60细胞培养于含10%胎牛血清、100 U/ml青霉素、100 U/ml链霉素和2 U/ml谷氨酰胺的RPMI 1640培养基内，于37℃，饱和湿度，5%CO2条件下培养, 细胞接种24 h后即处于指数生长期。
       2.2   SRB法测定硒化壳聚糖对细胞的抑制作用［4］收集对数生长期细胞以全培养液稀释成5×104个/ml单细胞悬液，接种于96孔细胞培养板，每个浓度复种4孔，每孔180 μl，每孔加入不同浓度硒化壳聚糖20 μl，对照组加入同量培养液，置37℃，5%CO2，饱和湿度的培养箱中孵育48h后，每孔小心加入预冷的80%醋酸50 μl，静置5 min后再将平板移至4℃放置1 h，倒掉固定液，用去离子水洗5遍，甩干，空气干燥，每孔加入100 μl SRB液，室温放置10 min，未与蛋白结合的SRB用1%醋酸洗5遍，空气干燥，结合的SRB用150 μl 10 mmol/L非缓冲Tris碱液（pH10.5）溶解，酶标仪检测550 nm波长光密度并计算抑制率，实验重复3次。
       2.3  HL60细胞克隆形成实验［4］参照文献配制半固体培养基，HL60细胞经不同浓度硒化壳聚糖作用48 h后， PBS洗去药物，离心1 000 r/min×3 min，用含20%小牛血清的RPMI-1640完全培养液稀释为7.0×103个/ml单细胞悬液,于24孔塑料培养板预加1.2%甲基纤维素培养基1.0 ml/孔，加入单细胞悬液50 μl，使每孔细胞数为350个,每个浓度设4个复孔。混匀后置37℃，5%CO2，饱和湿度的培养箱中孵育10～12 d后于倒置显微镜下计数细胞克隆数，计算细胞存活率（给药组平均克隆数/对照组平均克隆数×100%）,实验重复3次。
       2.4  流式法检测细胞凋亡及周期阻断作用HL60细胞经不同浓度硒化壳聚糖作用48 h后，收集细胞，加70%乙醇1 ml，-20℃固定24 h，加入ＰＩ (终浓度为50 μl/ ml)和ＲＮＡ酶(终浓度为0.25 mg/ ml)，室温下避光孵育30 min，用流式细胞仪作DNA分析，以ModFit LT软件分析，拟合计算各时相细胞的百分比。
       2.5   Western blot法观察WTI蛋白的表达分别收集经不同浓度硒化壳聚糖作用48 h后的HL60细胞各3×105个，PBS洗2次，裂解，离心，收集上清，即为细胞总蛋白，进行蛋白定量，调节每份样品蛋白浓度，加等量蛋白于上样缓冲液，煮沸，在ＳＤＳ聚丙烯酰胺凝胶中进行电泳。电泳后转膜，依次加入WTI一抗和二抗，显色，拍照，用Quanti Scan软件进行密度扫描分析。
       2.6   统计学处理
       全部数据均以±s表示，应用SPSS 12.0统计软件进行t检验。
       3  结果
       3.1   硒化壳聚糖对HL60细胞增殖的影响不同浓度硒化壳聚糖可对HL60细胞产生不同程度的抑制作用，随着硒化壳聚糖浓度增加，抑制作用也随之增强；细胞克隆形成实验结果显示，细胞存活率与硒化壳聚糖浓度呈剂量相关，硒化壳聚糖低、中、高剂量（25，50，100 mg/L）组细胞存活率分别为64.8%，49.9%，22.1%，HL60克隆原细胞存活率随硒化壳聚糖浓度加大呈指数下降。见表1。表1  硒化壳聚糖对HL60细胞增殖的影响（略）
       3.2   流式法检测细胞凋亡及周期阻断作用结果显示，不同浓度硒化壳聚糖处理48h后，细胞凋亡率随剂量加大而增加，硒化壳聚糖处理组HL60细胞明显阻滞在细胞周期的静止期（G0期）和DNA合成前期（G1期），50 mg/L 和100 mg/L硒化壳聚糖作用细胞48 h后，G0/G1期细胞数较对照组增加了14.9%和22.0%（P<0.05）；相应地，DNA合成期（S期）细胞减少了14.3%和20.1%（P<0.05），但DNA合成后期（G2期）和分裂期（M期）细胞无明显改变（P＞0.05）。结果见图1和表2。表2  硒化壳聚糖对HL60细胞周期时相的影响（略）
       3.3  硒化壳聚糖对HL60细胞WTI蛋白的影响凝胶电泳显色后可见，未加药组WTI的条带最明显，25 mg/L硒化壳聚糖对WTI蛋白影响不明显， 50 mg/L可下调WTI蛋白量，下调率为38.2%，100 mg/L下调率为64.3%。结果见图2和表3。表3  WTI蛋白条带灰度分析结果（略）
       4  讨论
          
       硒是人和动物体内必需的微量元素之一，大量的流行病学调查和体内外实验都已证实硒对包括血液病在内的多种肿瘤都具有显著的化学预防和治疗作用［5］。然而常用的无机补硒剂如亚硒酸钠虽然含硒量高，但存在着不易被细胞吸收，活性和毒性范围较窄，致死量LC50相对较小，具有蓄积性毒性和致突变作用，使用时剂量难以控制等缺点而应用受限。硒化壳聚糖是将硒酸根吸附于壳聚糖单体2-NH2和6-OH制备成的低分子量有机硒，可有效克服无机硒的上述缺点，理论上应该比无机硒具有更强的抗肿瘤作用，且毒副作用也应该小得多。
        恶性肿瘤的发生与肿瘤细胞的增殖和凋亡之间的失调有关，许多抗肿瘤药物可通过抑制肿瘤细胞增殖和（或）诱导肿瘤细胞凋亡产生作用。我们采用流式细胞仪进行DNA分析发现，经25，50，100 mg/L硒化壳聚糖作用HL60细胞48 h后，细胞凋亡率随剂量加大而增加，细胞明显被阻滞于G0/G1期，S期细胞显著减少，由于细胞增殖的速度主要取决于细胞周期的长短，而细胞周期的长短主要决定于G1期，G1期阻滞可使细胞增殖周期延长，部分细胞出现凋亡。
        细胞持续分裂和不断增殖是癌细胞的一个重要特征，因而对癌细胞增殖的抑制效果也是诱导癌细胞凋亡的一个重要鉴定指标［6］。本研究在体外用SRB法和克隆形成实验检测了硒化壳聚糖对HL60细胞增殖产生的作用，结果显示硒化壳聚糖可剂量依赖性地抑制HL60细胞增殖，降低细胞的存活率，其中，克隆形成实验可反映出单个细胞的增殖潜力［7］，通过实验证实了硒化壳聚糖不仅对处于增殖期的早幼粒白血病细胞有抑制作用，还对肿瘤干细胞也有明显的生长抑制作用，这比单纯抑制或杀死癌细胞本身具有更大的参考价值［8］。
        WTl(wilms tumor)基因是位于11p13编码相对分子质量(52～54)×103 的锌指转录因子。近年研究显示 WTl在白血病中高表达，WTl表达与造血细胞分化程度与预后呈负相关，并可能导致白血病的发生［9］。本研究中我们应用免疫印迹法检测WTI蛋白在硒化壳聚糖（0～100 mg/L，48 h）处理和未处理的人早幼粒白血病细胞中的表达情况，结果发现与未处理组相比较，经硒化壳聚糖处理过的人早幼粒白血病细胞中WTI明显下降，此结果表明，在抑制人早幼粒白血病细胞生长和促进其凋亡的过程中，硒化壳聚糖诱导的WTI表达降低可能发挥着极其重要的作用。
       【参考文献】
         　　［1］Zarzycki R，Modrzjewska Z. Use of chitosan in medicine and biomedical engineering ［J］. Polim Med., 2003, 33 (1-2) : 47.
       
       ［2］孙兰萍,张胜义,许 晖. 硒化壳聚糖的制备及理化性质的研究［J］.食品工业科技 , 2006,27(2):145.
       
       ［3］李柱来,林 媚,王 晶,等.硒化壳聚糖的制备及其表征［J］.海峡药学,2005,17(3):10.
       
       ［4］韩 锐.抗癌药物研究与实验技术［M］.北京:北京医科大学中国协和医科大学联合出版社，1996:284.
       
       ［5］Schrauzer G. N. Effects of selenium and low levels of lead on mammary tumor development and growth in MMTV-infected female mice［J］. Biol Trace Elem Res,2008 ,25(3):268.
       
       ［6］大星章一,管野晴夫，吴政安，等.癌细胞的增殖与分化［M］.北京：科学出版社1979:219.
       
       ［7］魏丽惠.体外人癌细胞对抗癌药物的敏感性（集落法与小孔法比较）［J］.北京医学院学报，1983，15（4）:307.
       
       ［8］潘启超，胥 彬.肿瘤药理学及化学治疗学［M］.广州：广东高等教育出版社，1989：45.
       
       ［9］SUGIYAMA H. Cancer immunotherapy targeting WTI［J］.Rinsho Ketsueki, 2003,44:995.