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       【摘要】 
       目的探讨益寿饮延缓D-半乳糖所致衰老作用机理。方法采用小鼠颈背部皮下注射D-半乳糖溶液制备小鼠亚急性衰老模型，空白对照组、模型对照组、阳性对照组（维生素E 20 mg/kg）和3个不同剂量的益寿饮给药组（1，2，3g生药/kg）分别灌胃45 d后，测定小鼠脾脏指数和全血中过氧化氢酶（CAT）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）活力。结果益寿饮高、中、低3个剂量组及阳性对照组均能显著提高亚急性衰老小鼠脾脏指数和全血中CAT和GSH-Px活力（P＜0.05，P＜0.01）。结论益寿饮对于D-半乳糖诱发的亚急性衰老模型有明显的延缓衰老作用。
       【关键词】  益寿饮延缓衰老；脾脏指数；过氧化氢酶；谷胱甘肽过氧化物酶
       Antiaging Effects of “YiShou Yin” in D-galactose-Induced Aging Mice
       YAN Zeran, FENG Lili, QIAO Qingbin, ZHEN Jianhua, BAI Yuting, YAO Ting, WANG Qingguo*
       (School of Basic Medical Sciences, Beijing University of Chinese Medicine, Beijing, 100029, China)
       Abstract：ObjectiveTo investigate the antiaging effect of “YiShou Yin” in aging mice induced by D-galactose.MethodsThe subacute aging model was establisned by subcutaneous injection of D-galactose daily for consecutive 45 days along the back mice. normal group, model group, positive drug group (Vitamine E 20mg/kg) and three different doses of “YiShou Yin” (1g crude drug/kg, 2 g crude drug/kg, 3 g crude drug/kg) groups were intragastrically administered for 45 days. The indexes of spleen, the levels of catalase (CAT) and glutathione peroxidese (GSH-Px) in blood were detected.ResultsCompared with model group, three doses of “YiShou Yin” and the positive drug improved the activities of CAT and GSH-Px in blood remarkably（P＜0.05，P＜0.01), and the indexes of spleen in “YiShou Yin” groups and the positive drug group were increased.Conclusion“YiShou Yin” shows a good antiaging action on the subacute aging model induced by D-galactose.
       Key words：YiShou Yin;  Antiaging;  Index of Spleen;  Catalase;  Glutathione Peroxidese
        中药益寿饮由莲子、山药等若干味中药提取制备而得。根据查阅相关书籍及文献资料，该方中各味药物均具有一定的益气养阴、延缓衰老作用。为了系统地研究该复方中药提取液的延缓衰老作用，笔者考察了益寿饮提取液对D-半乳糖所致亚急性衰老小鼠的脾脏指数、全血中过氧化氢酶（CAT）和谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）活力的影响，从而对益寿饮提取液延缓衰老的效果及作用机理进行初步探讨。
       1  材料与仪器
       1.1  动物健康二级昆明种小鼠72只，雌雄兼半，体质量在18～22 g，由中国医学科学院实验动物研究所提供，SCXK（京）2005-0013。
       1.2  药物益寿饮提取液：由中药莲子、山药等按照处方经水提取后浓缩制备，本实验室自制；阳性药物维生素E胶丸（批号20080124），由北京双鹤药业生产；D-半乳糖（批号20071201），购自北京化学试剂公司。
       1.3  试剂CAT试剂盒（批号：20080518）、GSH-Px试剂盒（批号：20080519），均由南京建成生物工程研究所生产。
       1.4  仪器752-紫外光栅分光光度计，上海分析仪器总厂制造；AE100电子天平，梅特勒-托利多仪器有限公司；LD5-2A离心机，北京医用离心机厂。
       2  方法
       2.1  动物分组与给药剂量将健康二级昆明种小鼠随机分成6组：空白对照组，模型对照组，益寿饮低剂量组、中剂量组、高剂量组和阳性对照组，各组小鼠皮下注射及灌胃剂量见表1。各组动物连续给药45 d，第46天精确称取小鼠体质量后，摘除眼球取血，待测CAT和GSH-Px活力；取血后将小鼠脱臼处死，分离小鼠脾脏，计算小鼠脾脏指数。表1  各组实验动物分组及给药剂量（略）
       2.2  测定指标及测定方法
       2.2.1  脾脏指数记录小鼠脾脏重量及体质量，按照下面公式计算脾脏指数。
       脾脏指数=脾脏重量/mg体质量/g
       2.2.2  全血中CAT测定方法取小鼠新鲜血液20 μl，加双蒸水980 μl，混匀配成1∶49的溶血液，按照试剂盒说明书进行测定。
       2.2.3  全血中GSH-Px测定方法取小鼠新鲜血液10 μl，加双蒸水1 490 μl，混匀配成1∶149的溶血液，充分混匀后，放置5 min直至玻璃管中的溶血液对光呈完全透明状，按照试剂盒说明书进行测定。
       2.3  数据统计方法实验数据用Statistica 6.0软件进行统计学处理。
       
       3  结果
       3.1  益寿饮对小鼠脾脏指数的影响由表2数据可以看出，皮下注射D-半乳糖溶液（100 mg/kg体质量）45 d后，模型对照组小鼠脾脏指数明显低于空白对照组，证明皮下注射D-半乳糖溶液制备得到的亚急性衰老小鼠模型具备自然衰老小鼠的特征，而3个给药剂量组及阳性对照组与模型对照组相比，小鼠脾脏指数分别提高了14.44%，21.04%，23.39%和14.43%。经统计学分析，空白对照组、阳性对照组、益寿饮中剂量组、益寿饮高剂量组与模型对照组之间均有显著性差异（P＜0.05），其中空白对照组、益寿饮中剂量组和高剂量组与模型对照组之间有极显著差异（P＜0.01）；空白对照组与阳性对照组、益寿饮低剂量组之间有显著差异（P＜0.05），其余各组之间均无显著性差异（P＞0.05）。表2  各组动物给药后脾脏指数变化（略）
       3.2  益寿饮对小鼠全血中CAT和GSH-Px的影响
       由表3数据可以看出，皮下注射D-半乳糖溶液（100 mg/kg体质量）45 d后，模型对照组小鼠全血中CAT和GSH-Px活力明显降低（降低百分率为67.88%和37.60%），而3个给药剂量组及阳性对照组与模型对照组相比，小鼠全血中CAT活力分别提高了110.54%，154.31%，190.70%和238.83%；GSH-Px活力分别提高了36.18%，38.43%，48.28%和35.17%。经统计学分析，空白对照组、阳性对照组及益寿饮低、中、高3个给药剂量组与模型对照组全血中CAT活力均有极显著性差异（P＜0.01）；益寿饮低剂量组、中剂量组与阳性对照组有显著性差异（P＜0.05），其中低剂量组与阳性对照组之间有极显著性差异（P＜0.01）；空白对照组与低剂量组、中剂量组有极显著性差异（P＜0.01）；低剂量组与中剂量组、高剂量组之间均有显著性差异（P＜0.05），其中低剂量组与高剂量组之间有极显著性差异（P＜0.01），其余各组相互之间均无显著性差异（P＞0.05）。表3  各组动物给药后全血中CAT和GSH-Px活力变化（略）
       4  讨论
        衰老一般是指机体生长发育成熟后，机体的生理功能逐渐下降，组织器官逐步发生退行性改变，并最终走向死亡的过程。衰老虽然是一切生物发展的自然规律，而且具有不可逆性，但是在一定条件下，衰老的速度是可以减慢的。从古至今，人们一直在探索衰老的机制，试图延缓衰老。到目前为止，有关衰老的学说有很多，有代表性的有自由基学说［1］、免疫学说［2］、线粒体学说［3］、内分泌功能减退学说［4］、端粒学说［5］等。本文从自由基和免疫学说两方面对益寿饮延缓衰老的作用机理进行了初步探讨。
        脾脏是细胞成熟分化成浆细胞的重要器官，反映体液免疫的功能，同时，脾脏还具有内分泌功能，是机体免疫-神经-内分泌网络调节环路中心的一个重要组成部分［6］。此外，脾脏是机体最大的周围淋巴器官，由白髓和红髓组成：白髓是密集的淋巴组织，围绕中央静脉而分布，由动脉周围淋巴鞘和脾小结组成，动脉周围淋巴鞘主要由大量T细胞构成，是脾内的胸腺依赖区，脾小结主要由B细胞构成；红髓由脾索和脾血窦组成。在人类，65岁以上老人免疫系统功能下降同时，脾生发中心数量和体积比26～30岁年轻人明显减少；大于22月龄小鼠脾内生发中心数量及其内的细胞数减少60%～95%［7］。随年龄的增长，白髓和红髓之间界限不清，白髓所占比例减小，脾小结不明显，免疫能力随之下降。本实验中模型对照组小鼠颈背部皮下注射D-半乳糖溶液促其衰老，也表现了这一组织学特征。而给药组小鼠在注射D-半乳糖同时，用益寿饮提取液或维生素E混悬液灌胃，其脾脏重量明显高于模型对照组，证明其脾小结明显多于模型对照组，动脉周围淋巴鞘明显，生发中心数量较多。说明益寿饮对亚急性衰老小鼠脾脏组织结构的衰退起到了抑制作用，即对老龄小鼠的脾组织起到了一定的保护作用，使之与空白对照组即青年小鼠的组织结构类似［8］。
        过氧化氢酶（CAT）是细胞内的一种抗氧化酶，它分布在红细胞、肝及肾的细胞中，它能够消除细胞新陈代谢的副产物过氧化氢。过氧化氢又名“双氧水”，它是活跃的强氧化剂，能引起氧化反应破坏细胞的新陈代谢过程，同时又会产生一系列新的氧化性活跃物质即自由基。由华盛顿大学医学院教授彼得·拉比诺维奇领导的这个研究小组发现，细胞内过氧化氢酶增加的实验鼠，寿命比对照组的实验鼠都有不同程度的增加。特别是细胞线粒体内增加过氧化氢酶的实验鼠，平均寿命达到4个半月，比对照组的实验鼠延长了20%。研究人员还发现，线粒体内过氧化氢酶增加的实验鼠，心肌纤维远比对照组的实验鼠健康，这表明过氧化氢酶保护了心肌细胞不发生衰老引起的病变。同时，这些实验鼠的细胞线粒体突变更少，基因中发生氧化的部分也更少。拉比诺维奇说，新研究成果的意义首先在于支持了自由基引起衰老的理论。这一理论认为，衰老首先是机体在细胞水平上受自由基损害的结果，自由基能干扰细胞的新陈代谢过程，损害基因，进而引起心脏病、癌症等，如果能保护细胞不受自由基的损害，那么不仅可以预防衰老相关的疾病，还可以延缓衰老进程。其次，新研究成果证明了线粒体在衰老过程中的关键作用，揭示了衰老发生的步骤。线粒体是细胞的“能源工厂”，在生成细胞能源的过程中会产生大量自由基，因此，在线粒体这个“源头”上防止自由基生成，将是延长寿命最有效的方法。本实验中，通过颈背部皮下注射D-半乳糖溶液造成的亚急性衰老小鼠模型全血中CAT活力明显低于空白对照组（即正常青年小鼠），而通过灌胃给予益寿饮提取液以后，可以拮抗CAT活力下降，使其维持在与正常小鼠大致相同的程度，与阳性对照药物相差不大，证明益寿饮提取液可以通过提高衰老小鼠体内CAT活力来起到延缓衰老的作用。
       
       GSH-Px是机体内重要的抗氧化酶类之一，它对由活性氧和羟自由基（OH-·）诱发的脂质氢过氧化物（LOOH）有很强的清除能力，可催化（LOOH）还原为带有羟基的脂质（LOH），也可催化过氧化氢的分解［9］。在细胞质中，GSH-Px一部分存在于线粒体内，在线粒体及胞浆中所产生的过氧化氢常靠GSH-Px清除，脂类中过氧化氢也可被GSH-Px清除。GSH-Px是含硒的酶蛋白，硒缺乏时其活性低下，导致组织细胞损害，引起老化、衰老。本实验结果表明，亚急性衰老小鼠体内的GSH-Px活力明显下降，而益寿饮提取液能够对抗由于衰老引起的这种下降，使之维持在正常水平左右。
        综上所述，笔者认为，益寿饮提取液具有明显的延缓衰老作用，其作用机理与消除体内多余自由基、提高机体抗氧化能力有关，并且是多个因素综合作用的结果。关于其他方面的作用机理及实用价值，有待于进一步研究。
       【参考文献】
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       ［3］吴小晶，吴丽娟，李晓东，等.线粒体 DNA 定量分析与衰老关系初探［J］ .中国老年学杂志，1999，5：315.
       
       ［4］Baynes JW,Thorpe SR.Role of oxidative st ress in diabetic complications:a new perspective on an old paradigm［J］.Diabetes,1999, 48: 1.
       
       ［5］朱武详，贾 春.端粒、 端粒酶与细胞衰老［J］ . 生物技术通讯，2002，13(5): 371.
       
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       ［7］唐孝礼，颜光美，许实波.海蛾提取物对小鼠免疫器官重量和抗应激能力的影响［J］.中药材，1999，22（6）：300.
       
       ［8］素玲，王艳华，吴朝晖.山药对老龄小鼠免疫器官组织结构的影响［J］.中国老年学杂志，2007，27（19）：1881.
       
       ［9］陈 缓，周 玫.自由基学［M］.北京：人民军医出版社，1991.