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       【摘要】 
       目的观察银杏内酯滴丸（bilobalide drop pill，BDG）对小鼠耐缺氧能力以及对大鼠心肌缺血损伤的影响。方法采用正常及异丙肾上腺素（Iso）诱导心肌缺血小鼠常压耐缺氧实验，观察银杏内酯滴丸对小鼠存活时间的影响；采用Iso诱导的大鼠心肌缺血模型，观察BDG对心电图、心肌含水量、血清乳酸（LD）和丙二醛（MDA）的含量、肌酸磷酸激酶（CK）、乳酸脱氢酶（LDH）和超氧化物歧化酶（SOD）的活力以及心肌组织病理形态学的影响。结果BDG（27，54 mg/kg）和BDG（13.5，27，54 mg/kg）可分别延长正常小鼠和心肌缺血小鼠常压耐缺氧条件下的存活时间；BDG（10.5，21，42 mg/kg）可以对抗心电图的ST段偏移；BDG（10.5，21 mg/kg）可以减少血清LD含量及降低血清LDH活力；BDG（10.5，21，42 mg/kg）可降低血清CK活力、提高SOD活力和减少MDA含量；BDG（21，42 mg/kg）可降低心肌含水量；BDG对心肌组织损伤有一定的改善作用。结论BDG能提高小鼠的耐缺氧能力，保护大鼠心肌缺血损伤，该作用可能与稳定心肌细胞膜、减少心肌酶的漏出、抗氧自由基有关。
       【关键词】  银杏内酯滴丸； 异丙肾上腺素； 缺氧； 心肌缺血
        缺血性心脏病的治疗一直是人们的关注的热点，药物治疗是最重要的手段之一。近年来的研究证实中草药在治疗心肌缺血性疾病方面有着独特的作用［1,2］，是新药研发的一个重要方向。银杏内酯是银杏叶提取物的有效部位，具有活血通经、散瘀止痛的功效。我们将银杏内酯制成滴丸，进行其药效学研究。本研究分别在异丙肾上腺素致小鼠缺氧和大鼠心肌缺血模型基础上，进一步探讨银杏内酯滴丸对心肌缺血的保护作用及其机制，为其临床应用提供依据。
       1   材料
       1.1  动物昆明种小鼠、SD大鼠，均由安徽医科大学实验动物中心提供（皖医实动准第01号）。
       1.2   药物与试剂银杏内酯（bilobalide drop pill, BDG）滴丸，合肥创新医药技术有限公司提供，批号：030926，每丸含银杏内酯15 mg，临用前用蒸馏水配制成所需浓度，实验所用剂量均为实际含银杏内酯量。银杏叶片（EGB, 每片含总黄酮醇苷9.6 mg，萜类内酯2.4 mg），黄石飞云制药有限公司产品，批号：20030501。实验所用剂量均指含黄酮醇苷和萜类内酯的总量，临用前用蒸馏水配制。异丙肾上腺素（Iso），上海禾丰制药有限公司，批号：20030616；钠石灰，上海陆都化学试剂厂产品，批号：20030102；水合三氯乙醛，上海白鹤化工厂产品，批号：990106；戊巴比妥钠，佛山市化工实验厂（进口分装），批号990901；乳酸脱氢酶(Lactate dehydrogenase ,LDH) 测定试剂盒，超氧化物歧化酶（Superoxide Dismutase ，SOD）测定试剂盒，丙二醛(Maleic Dialdehyde ，MDA) 测定试剂盒，肌酸磷酸激酶（CK）检测试剂盒，乳酸（LD）检测试剂盒均由南京建成生物工程研究所提供。
       2   方法
       2.1  小鼠常压耐缺氧实验
       2.1.1  正常小鼠常压耐缺氧实验［3,4］
       取18～22 g小鼠60只，随机分成5组：即对照组、BDG低、中、高（13.5，27.0，54.0 mg /kg） 3个剂量组及EGB（10.8 mg/kg）组，每组12只，♀♂各半。灌胃（ig）给药，qd·7 d，其中对照组和模型组给予等容量的辅料。末次给药后1 h，立即将各组小鼠分别放入盛有10 g钠石灰的250 ml的广口瓶中，用凡士林涂抹瓶口盖严，使之不漏气；立即计时，以小鼠呼吸停止为死亡指标，观察记录小鼠因缺氧至死亡的时间，按公式换算成标准耐受时间T。校正时间T＝ T0/ (V0-W/0.94) 250。式中T:标准缺氧存活时间（min）；T0：原始缺氧存活时间(min)；W：小鼠体质量（g）；V0：原始瓶容量（ml）；0.94为小鼠比重。校正时间T为相当于250 ml有效空气量的标准存活时间。
       2.1.2   Iso诱导心肌缺血小鼠常压缺氧模型［5］
       取18～22 g小鼠72只，随机分成6组：即对照组，模型组，BDG低、中、高 （13.5，27.0，54.0 mg /kg） 3个剂量组及EGB（10.8 mg /kg）组，每组12只，♀♂各半。灌胃（ig）给药，qd·7 d，其中对照组和模型组给予等容量的辅料。末次给药后1 h，对照组多点皮下注射（sc）等容量NS,其余各组多点sc Iso 10 mg/kg, 注射后立即将各组小鼠分别放入盛有10 g钠石灰的250 ml的广口瓶后，实验方法同“2.1.1”项。
       2.2  ISO诱导的心肌缺血大鼠模型［6］
       按Rona法进行改良后复制心肌损伤大鼠模型，取SD大鼠48只，体质量180～280 g，♀♂各半，随机分为6组：即对照组，模型组，BDG低、中、高(10.5，21.0，42.0 mg/kg)3个剂量组和EGB（8.4 mg/kg）组，每组8只。ig给药，qd·7 d，其中对照组和模型组ig等量的辅料。在ig的第6天，记录各组大鼠造模前肢体Ⅱ导联心电图后，除对照组sc等容量NS外，其余各组均sc Iso 5 mg/kg，24 h后重复1次，分别记录sc后的1，5，10，15 min的肢体Ⅱ导联心电图，观察S-T段的总偏移幅度。2 h后腹主动脉取血，分离血清，严格按试剂盒规定要求，测定血清中LD，CK，LDH，SOD和MDA变化。脱颈椎处死大鼠，迅速取出心脏，以冰盐水洗净，去除大血管及结缔组织，取心尖部心肌组织置于10%甲醛溶液中固定，HE染色，光镜下组织形态学观察。其余心肌称重，85℃烘箱干燥24 h至恒重后取出称重，计算心肌含水百分率。心肌含水百分率(%)=(湿重-干重/湿重)×100%。
       2.3   统计方法 
       所有计量资料以±s表示，采用单因素方差分析，组间t检验，所有统计分析采用SPSS软件包完成。
       3  结果
       3.1   BDG对正常小鼠常压缺氧存活时间的影响
       见表1。与对照组比较，BDG （27.0，54.0 mg /kg）能够明显延长小鼠实际存活时间和校正后存活时间。表1  BDG对常压耐缺氧小鼠存活时间的影响（略）
       3.2   BDG对Iso诱导心肌缺血小鼠常压缺氧存活时间的影响  
       结果如表2所示。与对照组比较，模型组小鼠存活时间明显缩短。与模型组比较，BDG 3个剂量（13.5，27.0，54.0 mg /kg）均可明显延长心肌损伤小鼠在常温常压缺氧条件下的存活时间（P＜0.01）。表2  BDG对Iso诱导心肌缺血小鼠常压缺氧的影响（略）
       3.3   BDG对心肌缺血大鼠 ∑-ST的影响
        
       结果如表3所示。与对照组比较，模型组大鼠的∑-ST有显著性差异；与模型组比较，BDG 3个剂量（10.5，21.0，42.0 mg/kg）和EGB均可以明显对抗心肌损伤大鼠ST段的总偏移幅度。表3  BDG对心肌损伤大鼠∑-ST的影响 （略）
       3.4   BDG对心肌缺血大鼠心肌含水百分率的影响 
       结果如表4所示。与对照组比较，模型组大鼠心肌含水率明显增加；与模型组比较，BDG（21.0，42.0 mg/kg）和EGB可以减少心肌损伤大鼠的心肌含水量，降低心肌含水百分率。表4  BDG对心肌损伤大鼠心肌含水百分率的影响（略）
       3.5    BDG对心肌缺血大鼠血清中LD，CK及LDH的影响   
       结果如表5所示， BDG（10.5，21.0 mg/kg）可以减少心肌损伤大鼠血清中LD的含量，同时降低血清中LDH的活力，BDG（10.5，21.0，42.0 mg/kg）均可降低血清中CK的活性。表5  BDG对心肌损伤大鼠血清LD、CK及LDH的影响 （略）
       3.6   BDG对心肌损伤大鼠血清中MDA及SOD的影响   
       结果如表6所示。BDG（10.5，21.0，42.0 mg/kg）均可以提高心肌损伤大鼠血清中SOD的活力，降低MDA含量。表6  BDG对心肌损伤大鼠血清中MDA及SOD的影响（略）
       3.7   BDG对心肌缺血大鼠心肌组织形态学的影响 
       结果如图1所示。在光学显微镜下，正常对照组心内膜内皮完整，心肌细胞横纹清晰，核正常，无水肿，间质未见血管扩张及炎细胞浸润。模型组大鼠心肌细胞损伤明显，心内膜内皮不完整，有多处片状坏死灶，间质内大量淋巴细胞、巨噬细胞弥漫性浸润，可见血管扩张充血。BDG（10.5，21.0，42.0 mg/kg）及EGB组心内膜内皮不完整，可见散在的细胞变性坏死，间质内有程度不等的淋巴细胞及巨噬细胞浸润，未见明显血管扩张，提示其对心肌缺血大鼠心肌组织损伤均有一定的保护作用。
       4  讨论
        心肌耗氧量测定是研究冠心病药物疗效的重要指标。正常小鼠的耐缺氧实验主要反应动物整体的耐缺氧能力，但在心肌缺血状态下，心肌的耗氧量会增加，在此状态下的整体动物耐缺氧实验更能准确反应缺血心肌对缺氧的耐受能力，因此本文同时观察了银杏内酯滴丸对正常小鼠和Iso诱导心肌缺血小鼠的耐缺氧作用。结果表明，银杏内酯滴丸使小鼠和心肌缺血小鼠在密闭缺氧条件下的存活时间明显延长，作用与银杏叶片相当。说明银杏内酯滴丸能提高机体的防护能力和应激能力。
       
       急性心肌缺血时ST段抬高程度与心肌血流量减少和氧张力降低密切相关，通过比较各组ST段的偏移程度，可以反映心肌缺血的程度并可作为评价抗心肌缺血药物疗效的指标之一。心肌水肿也是心肌缺血损伤的一个突出变化。实验中银杏内酯滴丸可以明显抑制ST段偏移总幅度，改善急性心肌缺血大鼠的异常ECG变化，减少模型大鼠的心肌含水量，提示其对Iso诱导的心肌缺血损伤有一定的保护作用。
        异丙肾上腺素可诱发心肌缺血，导致膜稳定性降低，导致酶的外漏，使血清中LD含量增加及LDH、CPK活力升高。血清中CPK、LDH活力可作为评价心肌缺血损害程度的客观指标，而CPK一般被认为是心肌细胞损伤最敏感的指标之一。银杏内酯滴丸可以明显减少血清中LD的含量，并降低LDH及CPK的活力。提示其可以通过稳定缺血心肌的细胞膜，减少血清中CPK、LDH的漏出，起到心肌缺血保护作用。大量氧自由基生成及脂质过氧化反应是心肌缺血性损伤的主要机制之一［7］，清除和抑制氧自由基的产生，可对缺血心肌起到保护作用。银杏内酯滴丸可以提高血清中SOD的活力，减少MDA的生成量，提示其可以增强内源性氧自由基清除系统的功能，抑制脂质过氧化，减轻其对心肌细胞的损伤，保护缺血心肌。
       
       综上所述，银杏内酯滴丸能提高小鼠的耐缺氧能力，保护大鼠心肌缺血损伤，该作用可能与稳定心肌细胞膜、减少心肌酶的漏出、抗氧自由基有关。
       【参考文献】
         　　［1］张根葆, 陈冬云, 桂常青,等. 银杏内酯B对缺血再灌注大鼠心脏保护作用的实验研究［J］. 中国中医药科技,2005,12(2):92.
       
       ［2］章红燕, 侯桂兰, 何福根. 银杏叶总黄酮和银杏内酯对心脑血管作用的研究进展［J］. 浙江临床医学,2008,10(4):543.
       
       ［3］万国兰, 李洪亮, 杨庆春, 等. 白花败酱草提取物耐缺氧作用的研究［J］. 时珍国医国药, 2008，19(5):1130.
       
       ［4］郭 秒, 方海侠, 吉训明, 等. 急性重复性低氧暴露对小鼠脑内乳酸脱氢酶表达的影响［J］. 中华神经科杂志, 2007,40(2):116.
       
       ［5］王雨梅，刘兴军，王敏伟．赞丹松汤口服液对实验性心肌缺血的影响［J］. 中国民族医药杂志, 2002，8(3):37.