文章标题 全文   多个检索词，请用空格间隔。

       【摘要】 
       目的以秀丽隐杆线虫细菌感染模型评价中药的体内抗菌作用，为发现新的抗菌先导物奠定基础。方法用铜绿假单孢菌、金黄色葡萄球菌分别感染秀丽隐杆线虫，用培养液配制不同浓度的中药提取物药液，将线虫置入药液培养，5 d后观察，根据成活率、线虫体内细菌数判断药效。结果水麻叶、黄连、大接骨丹、知母、茯苓、当归、桃仁、山豆根、白虎汤对感染细菌的秀丽隐杆线虫显示出较好的保护效果，其中水麻叶作用最强；对9种提取物做体外抑菌实验，除黄连具有较弱的抗菌效果外，其它8种提取物当浓度为1 600 μg·ml-1时均无抗菌活性，但在较低浓度时（100～800 μg·ml-1）对线虫产生体内抗菌作用，与阴性对照比，降低线虫体内细菌数10～100倍。结论秀丽隐杆线虫易于培养，可感染多种细菌，具有免疫系统，繁殖成本低，适宜用于体内抗菌药物的筛选。
       【关键词】  秀丽隐杆线虫； 中药； 体内抗菌
        由于抗生素的出现，细菌感染性疾病得到控制，但是细菌也随之对抗生素产生耐药性，这种局面促使人类必须不断开发新的抗菌药物。中草药用于治疗细菌感染类疾病已经有几千年的历史，与西医注重病原体的分离鉴定不一样，中医将细菌感染分为不同的“证”，强调“辨证论治”，强调人的体质因素。一些中药或方剂，如白虎汤，体外试验无明显的抗菌作用，但确有很好的体内抗感染疗效［1，2］，说明对中草药抗菌功能的认识不能仅停留于体外抑菌试验，应该注重中药的体内抗感染作用。
        秀丽隐杆线虫是著名的模式生物，近年来已被用于药物筛选。Evason 等［3］发现，抗癫痫药物乙琥胺（ethosuximide）能使秀丽隐杆线虫的寿命延长17%，并存在明显的量效关系。蔡外娇等［4］发现淫羊藿总黄酮能延缓秀丽隐杆线虫衰老。2006年Ausubel等［5］首次用粪肠球菌（E. faecalis）感染秀丽隐杆线虫，建立了体内抗菌药物筛选方法，发现有些化合物和植物提取物体外无抗菌活性，但具有体内抗细菌感染活性。Breger等［6］建立了白色念珠菌秀丽隐杆线虫感染模型，发现部分化合物具有体内抗菌作用。可见，秀丽隐杆线虫可以用于体内抗菌中草药的筛选。
        本实验分别用铜绿假单孢菌、金黄色葡萄球菌感染秀丽隐杆线虫，观察了部分中草药及方剂的提取物对秀丽隐杆线虫细菌感染模型的抗菌效果。
       1  材料与方法
       1.1  线虫、菌株N2野生型秀丽隐杆线虫（C. elegans, Bristol strain N2）和E.coli OP50 由北京生命科学研究所王晓晨博士惠赠。铜绿假单孢菌（ATCC 27853）、金黄色葡萄球菌（ATCC 25923）由贵州省、中国科学院天然产物化学重点实验室惠赠。
       1.2  药材黄连、金银花、白芷、山豆根、大黄、生地、玄参、白术、苍术、茯苓、麻黄、桂枝、薄荷、荆芥、防风、丹参、红花、当归、桃仁、党参、山药、黄芪、厚朴、陈皮、草乌、吴茱萸、枸杞、锁阳、钩藤、白虎汤（生石膏20 g、知母12 g、甘草4 g、粳米12 g）购自贵阳市药材公司，刺三甲（根）、爬山虎（茎）、大接骨丹（根皮）、水麻叶（根）、杠板归（茎叶）、滇白珠（根）、马鞭草（全草）、鸡屎藤（茎）、千里光（全草）、葛根（根）、杜仲（树皮）、六月雪（茎叶）、商陆（根）采自贵阳市郊区。
       1.3  试剂、NGM培养基、M9缓冲液头孢曲松钠（西南合成制药股份有限公司），琼脂粉、蛋白胨、牛肉浸膏（北京双旋微生物培养基制品厂），叠氮钠（Sgima公司），其余试剂均为国产分析纯。
       1.3.1  NGM培养基1 000 ml的NGM培养基含2.5 g蛋白胨，3 g NaCl，17 g 琼脂，1 mol·L-1 PBS液（pH=6.0）25 ml，975 ml蒸馏水，灭菌后加入滤膜除菌的1 ml胆固醇溶液（5 mg·ml-1 乙醇），1 mol·L-1 MgSO4 1 ml，1 mol·L-1 CaCl2 1 ml 。
       1.3.2  M9缓冲液1 000 ml的M9缓冲液含15.12 g Na2HPO4·12H2O，3 g KH2PO4，5 g NaCl， 0.25 g MgSO4·7H2O。
       1.4  中草药提取物制备药材粉碎成过20目筛的颗粒，用70%的乙醇溶液回流提取2次，1h/次，合并提取液，用滤纸过滤后蒸干，置棕色小瓶中冰箱保存。白虎汤用蒸馏水回流提取，余同上。
       1.5  提取物母液的配制实验前用0.05 mol·L-1的PBS液(pH=7.0)将提取物配制成1 600 μg·ml-1的母液，用直径为0.45  μm的滤膜过滤除菌，置冰箱保存备用。
       1.6  秀丽隐杆线虫细菌感染方法按照Ausubel等建立的方法进行［5］。从怀孕成虫分离虫卵，在M9缓冲液中孵化过夜，得到L1期幼虫，将幼虫转移到NGM培养基的E.coli菌苔上在25℃培养箱中继续生长48 h，得到L4青年成虫，用M9缓冲液洗脱虫体并反复清洗3～4次后，将虫体分别转移到普通琼脂平板的铜绿假单孢菌和金黄色葡萄球菌的菌苔上，在25℃培养箱中培养8 h进行感染，感染后转移到96孔板的M9缓冲液中（缓冲液蛋白胨含量为2%、牛肉浸膏含量为4%）继续培养，观察记录每日死亡情况。线虫变成直线型、无移动、用铂金丝轻触无反应判为死亡。
       1.7  体内抗感染筛选按照Ausubel等［5］建立的方法进行。配制蛋白胨含量为2%、牛肉浸膏含量为4%的M9缓冲液，用96孔板进行筛选，第1排为阴性对照，每排8孔，注入M9缓冲液100μl；第2～11排为受试中草药提取物样本，每排8孔，每孔先加入M9缓冲液100 μl，然后在往第1孔加入提取物母液100μl，混匀后从第1孔吸取100 μl加入到第2孔，重复上述步骤，自第8孔时吸取100μl弃去，这样得到提取物浓度分别为800，400，200，100，50，25，12.5，6.25 μg·ml-1的系列溶液；第12排为阳性对照（头孢曲松钠），药物浓度分别为25，12.5，6.25 μg·ml-1，每个样本做两份。将感染后的虫体加入孔中，每孔10条。然后用保鲜膜覆盖密封，置25℃培养箱中培养5 d，培养箱相对湿度在80%～85%之间。5 d后同一样本在两张板中成活的线虫都超过5条视为有效，如其中一张板成活的线虫不足5条，但另一张板成活的线虫超过8条仍视为有效，不能满足上述成活数则判为无效，对初筛有效的样本，再进行复筛验证。
       1.8  虫体内细菌计数按照Ausubel等建立的方法进行［5］。先用含叠氮钠1mmol·L-1的M9缓冲液清洗虫体，抑制虫体表面细菌，再用灭菌后的不含叠氮钠的M9缓冲液清洗，将虫和200 μl的M9缓冲液加入微型离心管中，再加入灭菌后的石英砂（直径约1 mm）200 mg左右，在振荡器上剧烈震荡1～2 min，破坏虫体，释放出细菌，取上清液稀释后在琼脂平板上培养计数。1.9  体外抑菌实验对在线虫体内有抗感染活性的样本，根据美国NCCLS标准，应用微量肉汤稀释法进行体外抑菌试验［7］。
       2  结果
       2.1  秀丽隐杆线虫细菌感染铜绿假单孢菌和金黄色葡萄球菌可以感染线虫。从图1可以看到，秀丽隐杆线虫被两种细菌感染1d后没有发现死亡，随后开始出现死亡，多次实验表明，被两种细菌感染后的线虫均在5 d内死亡。
       2.2  体内抗菌与体外抗菌实验对43个提取物样本进行了秀丽隐杆线虫的体内抗菌实验，结果表明（见表 1），中草药水麻叶、黄连、大接骨丹、知母、茯苓、当归、桃仁、山豆根具有体内抗菌作用，方剂白虎汤对感染细菌的秀丽隐杆线虫也显示出较好的保护效果。水麻叶的作用最强，其次为白虎汤和大接骨丹。表1  中草药对秀丽隐杆线虫的体内抗菌效果（略）
         
       对9种提取物做体外抑菌实验，除黄连具有较弱的抗菌效果外，其它8种提取物当浓度为1 600 μg·ml-1时均无抗菌活性。阳性对照药头孢曲松钠体内抗菌活性强，但其体内抗菌浓度大约是体外抑菌浓度的3倍。9种提取物虽然体外无活性，但体内抗菌浓度均低于1 600 μg·ml-1，在100～800 μg·ml-1之间。
        为评价药物清除线虫体内细菌的能力，感染5 d后破坏成活的虫体，测定体内活菌数，与阴性对照组（该组系感染3 d后测定，因为5 d后虫体已经全部死亡），水麻叶大约使体内细菌数降低了近100倍，与阳性对照药接近，其它8种提取物降低体内细菌数10倍左右。
       3  讨论
        中医理论认为“正气内存，邪不可干，邪之所凑，其气必虚”。抗生素用于抗感染治疗主要是通过抑菌或杀菌而减轻或终止感染，一般不考虑培补“正气”。中医对细菌感染的遣方用药是在“辨证论治”的指导下确立的，因此，用中草药治疗细菌感染不单纯局限于抑菌或杀菌。邓文龙认为中草药治疗细菌感染不是仅凭体外抗菌实验就可以阐释的，应从细菌感染过程、毒力、侵袭力、对免疫功能的调节等方面探索其临床取效的药理学基础［8］。
       
       实验结果表明，在浓度为1 600 μg·ml-1时，除黄连外，其余8种提取物具有体内抗菌作用的提取物均无抗菌活性，但是在浓度低于1 600 μg·ml-1时对线虫产生了保护效果，与Ausubel等［5］的研究报道有相符之处。针对这种现象，Ausubel认为在体内具有抗菌作用的样本与下列机制有关：①药物进入线虫体内后发生生物转化，结构改变，抗菌活性增强；②提高线虫的免疫功能，细菌繁殖受到抑制；③影响细菌毒力因子的表达［5］。秀丽隐杆线虫易于培养，可感染多种细菌，具有免疫系统，遗传背景清晰，繁殖成本低，适宜用于体内抗菌药物的筛选。
       
       白虎汤具有体内抗菌作用，我们将石膏、知母、甘草、粳米分开，单独使用，发现知母提取物也对线虫产生保护效果；白虎汤去知母，则缺乏体内抗菌作用，但是，白虎汤的体内抗菌作用比单独使用知母强。因此，推测白虎汤的体内抗菌作用与知母有关，其它几味药增强了知母的体内抗菌作用，进一步证明，白虎汤的组方具有合理性。
        水麻叶属于民间草药，具有利湿、清热、退黄等功效，在本次实验中对线虫产生的保护作用最好，有关水麻叶抗菌作用的研究不多，我们对水麻叶体内抗菌活性成分的活性跟踪分离工作正在进行中。大接骨丹、当归、桃仁属于活血祛瘀类药物，但显示具有体内抗菌活性。黄连、山豆根是常用的清热解毒药，均存在体内抗菌作用，而同为清热解毒药的金银花、白芷对感染细菌的线虫未产生保护效果。茯苓属渗湿利水药，体外无抗菌作用，但有体内抗菌效果。上述事实说明，用秀丽隐杆线虫筛选体内抗菌中药其结果不一定存在规律性。本实验应用秀丽隐杆线虫细菌感染模型对少数中草药的体内抗菌作用进行了初步探索，由于线虫与人体在结构、功能等方面的差异大，因此，筛选结果能否为临床用药提供依据尚存在疑问，需进一步做深入研究。但是，这种方法可以获得一些与体内抗菌有关的有价值的信息，比如桃仁、当归、茯苓等具有体内抗菌效果，在以往的研究中很少见到报道。
        在实验中发现商陆提取物对线虫毒性较大，当浓度为400 μg·ml-1时线虫在1 h内全部死亡。草乌对人的毒性较大，但当草乌提取物浓度为800 μg·ml-1时线虫仍然能成活36 h，因草乌主要存在心脏毒性，估计与线虫缺乏分化明显的心肌细胞有关。秀丽隐杆线虫已经广泛用于环境毒理学的研究［9］，作为初筛应该是可取的，但是像草乌这样一些具有特殊靶器官毒性的物质难以用线虫发现其毒性。
        细菌的耐药性问题已经对人类健康构成威胁，中草药无疑是发现新的抗菌药物的重要源泉，中草药的成分复杂，其体内抗菌作用可能涉及多种机制，仅采用体外抑菌实验难以全面评估其体内抗菌作用，利用秀丽隐杆线虫建立细菌感染模型，对中草药及方剂进行体内筛选研究，可能为发现具有新作用机制的抗菌先导物提供便利。
       【参考文献】
         　　［1］谢存柱. 柴胡白虎汤治疗急性化脓性扁桃腺炎［J］. 云南中医杂志，1993， 6:16.
       
       ［2］张双斌. 柴葛白虎汤治疗外感高热44例［J］. 江西中医药，1990，21 (3): 25.
       
       ［3］Evason K, Huang C, Yamben I, et al. Anticonvulsant medications extend worm life-span ［J］. Science, 2005, 307 (12): 258.
       
       ［4］蔡外娇，张新民，黄建华，等. 淫羊藿总黄酮延缓秀丽隐杆线虫衰老的实验研究［J］. 中国中西医结合杂志，2008，28 (6):522.
       
       ［5］Moy TI., Ball AR., Ausubel FM, et al. Identification of novel antimicrobials using a live-animal infection model ［J］. Proc Natl Acad Sci U S A， 2006， 103 (27): 10414.
       
       ［6］Breger J， Fuchs BB, Aperis G, et al. Antifungal chemical compounds identified using a C.elegans pathogenicity assay ［J］. PLoS Pathogens，2007， 3 (2):168.
       
       ［7］National Committee for Clinical Laboratory Standards. Methods for Dilution Antimicrobial Susceptibility Tests for Bacteria that Grow Aerobically-Sixth Edition: Approved Standard M7-A6 ［M］.Wayne，PA，USA，2003: 124.
       
       ［8］沈映君. 中药药理学［M］. 北京: 人民卫生出版社， 2000: 323.
       
       ［9］Sochová I， Hofman J, Holoubek I.Using nematodes in soil ecotoxicology ［J］. Environ Int., 2006,32(3):374.