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       【摘要】 
       目的以鱼腥草为材料，研究鱼腥草蛋白酶抑制剂(HCTI)的分离提取工艺。方法HCTI的最佳粗提条件是采用pH 7.0的双蒸水为提取溶剂，在体积比为1∶30， 45 ℃条件下浸提2.0 h，提取2次。硫酸铵部分沉淀后，再经DEAE-52离子交换层析柱纯化。结果粗提液经45％～60％饱和度的硫酸铵沉淀比活力最高，经过DEAE-52离子交换层析柱梯度洗脱后，检测到HCTI活性峰。结论用DEAE-52离子交换层析柱可分离纯化HCTI，SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，计算出该HCTI的分子量约为28 KDa。
       【关键词】  胰蛋白酶抑制剂； 鱼腥草； 分离纯化
       The Extraction and Purification of Trypsin Inhibitor from Houttuynia cordata Thunb
       FU Xuanhe1, LIU Tongxiang2, ZHANG Zongshen1*
       1.School of Biology and Food Engineering, Dalian Polytechnic University, Dalian, 116034， China； 2. Minority Traditional Medical Center, Minzu University of China, Beijing 100081,China
       Abstract：ObjectiveTo study the isolation and purification procedure of TI from Houttuynia cordata Thunb. MethodsThe optimal criteria of TI extraction were 45 ℃, 30 times of solvent volume, pH 7.0 and 2 h. The combination of ammonium sulphate precipitation and DEAE-cellulose column chromatography was used to purify the TI. ResultsThe specific activity peak of TI occurred in the part of 45%～60% (NH4)2SO4 precipitation, and was consequently purified by DEAE-cellulose column gradient elution, and the activity of TI could be detected. ConclusionThe HCTI can be purified with DEAE-cellulose column, and the molecular weight of HCTI is determined by SDS-PAGE as 28 KDa.
       Key words：Trypsin inhibitor;   Houttuynia cordata Thunb;   Isolation and purification
       
       胰蛋白酶抑制剂(Trypsin inhibitor ,TI)除了在临床上用来治疗急性胰腺炎、肺气肿、脑水肿和脑缺血外，目前还发现它在HIV和肿瘤的治疗中也有重要意义［1］。化学合成的TI生物利用度低、副作用大以及产生耐药性等缺点，植物来源的TI具有兼容性好、安全和特殊的药物特性等优点。因此，从传统中药中筛选具有TI有活性的材料有很广阔的应用前景和市场价值。
       鱼腥草为三白草科植物蕺菜Houttuynia cordata Thunb的地上部分，具有清热解毒、消痈排脓、利尿通淋之功效，是临床应用极其广泛的中药之一。本文在前期研究的基础上，对鱼腥草中TI进行了分离纯化，获得的结果对开发植物来源的TI具有重要意义。
       1  材料与仪器
       1.1   试剂胰蛋白酶(北京麒麟宏伟公司) ，苯甲酰DL-精氨酸对硝基苯胺(上海三杰生物技术有限公司)，DEAE-纤维素(Sigma)，三-羟甲基-氨基甲烷，无水氯化钙，盐酸，三氯乙酸，氢氧化钠等为国产分析纯。
       1.2  仪器可见光分光光度计，高速冰冻离心机，精密pH 计，数显恒温水浴锅，精密电子天平，蛋白质电泳仪等。
       2  方法
       2.1  鱼腥草胰蛋白酶抑制剂抑制率的测定参考杜旭东等［2，3］的苯甲酰DL-精氨酸对硝基苯胺(BAPNA)法。
       2.2  鱼腥草胰蛋白酶抑制剂的分离与纯化参考康庄等［4］的方法进行。
       3  结果
       3.1  硫酸铵分级沉淀按照硫酸铵沉淀表，对样品浸提液添加硫酸铵至30％，45％，60％，75％饱和浓度，分别测定各浓度下的体积、抑制活性和蛋白浓度。pH值为6.0的样品浸提液实验结果见表1，pH值为8.0的样品浸提液实验结果见表2。表1  pH 6.0条件下硫酸铵分级沉淀TI的结果（略）表2  pH 8.0条件下硫酸铵分级沉淀TI的结果（略）
        
       从图1可以看出，两种不同pH体系活性析出均集中于30％～75％饱和度，但45％～60％饱和度下比活力最高，且pH 8.0体系时比活力大。因此，在以后的纯化过程中，均采用pH 8.0溶液体系对样品液进行硫酸铵分级沉淀，加(NH4)2SO4至40％饱和度，以除去碱性或中性杂蛋白。再加(NH4)2SO4至60％饱和度，收集沉淀，溶解透析供下步离子交换层析用。抑制剂的析出在pH 6.0体系比pH 8.0体系要早，这说明抑制剂可能是一种酸性蛋白。
       3.2  DEAE-52离子交换分离纯化取pH 8.0 Tris-HCl缓冲液透析后的粗提液5 ml，上DEAE-52离子交换柱(ф 2.5 cm×15 cm),流速为0.75 ml/min，以50 ml缓冲液洗脱,使样品液压实，再分别用由缓冲液配制的60～400 mmol NaCl溶液进行梯度洗脱，所得各管洗脱液(每管收集3 ml)在紫外光280 nm下测其吸光度，检测蛋白含量，其梯度洗脱曲线见图2。
       由图3可知, 在55～70号试管具有HCTI活性，以60～63号活性最高。收集60号试管及附近活性较高的试管保存，进一步处理后进行HCTI相对分子量的测定。洗脱液的浓度梯度与试管号的对应关系见表3。表3  洗脱液的浓度梯度与试管号的对应关系（略）
       3.3  鱼腥草胰蛋白酶抑制剂的相对分子量的测定 
       DEAE-52离子交换柱分离纯化后HCTI液的活性峰经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳。结果如图4。
       由电泳图谱上测定的标准蛋白相对迁移率及其分子量，待测蛋白的迁移率为0.530。经计算机处理数据后，得回归方程：LogY=－1.355X+5.165 3 如图5所示，将待测的蛋白相对迁移率带入方程，计算出HCTI的分子量约为28 kDa。
       4  讨论
       
       本实验在粗提过程中采用分级盐析法除掉了部分杂蛋白，分离过程中用到了DEAE-52离子交换层析法，并检测到活性峰。说明分级盐析发挥了一定作用，从而简化了分离纯化过程，测得HCTI分子量约为28 kDa。为该胰蛋白酶抑制剂的进一步深入研究奠定了一定的理论基础。
       【参考文献】
         　　［1］刘同祥,牛建昭,杜旭东,等.具有蛋白酶抑制剂活性成分中药的筛选［J］.中国中药杂志, 2007, 32 (7) :643.
       
       ［2］杜旭东,刘同祥,张宗申,等.正交实验法优选鱼腥草胰蛋白酶抑制剂的提取工艺［J］.时珍国医国药,2007,18(10):2337.
       
       ［3］杜旭东,刘同祥,张宗申,等.超声波法提取胰蛋白酶抑制剂［J］.时珍国医国药,2008,19(3):525.
       
       ［4］康 庄,王 竞,杜林方.菠菜种子胰蛋白酶抑制剂的分离纯化与部分性质研究［J］.天然产物研究与开发,2005,17(2):143.