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       【摘要】 
       目的研究愈风颗粒对大鼠脑缺血再灌注损伤模型脑神经细胞凋亡及bcl-2,bax表达的影响。方法将脑缺血再灌注损伤大鼠分为3组：中药组，西药组及模型组，另设正常组作对照。观察各组大鼠脑组织TUNEL及bcl-2,bax表达的变化。结果模型组大鼠脑组织TUNEL阳性数，bcl-2，bax阳性细胞数显著高于正常组，bcl-2/bax比值显著低于正常组（均P<0.01）；中药组及西药组脑组织TUNEL阳性数，bax阳性细胞数显著低于模型组，bcl-2阳性细胞数及bcl-2/bax比值显著高于模型组(均P<0.01)。结论愈风颗粒有明显的抗凋亡作用，其作用机制可能与下调促凋亡基因bax水平，上调抗凋亡基因bcl-2水平，提高bcl-2/bax比值有关。
       【关键词】  愈风颗粒； bcl-2； bax； 细胞凋亡
        愈风颗粒为自拟方药，有通腑泄热、凉血解毒之功，主要用于急性期脑梗塞的治疗。为探讨其作用机制，为临床提供依据，本实验研究愈风颗粒对脑缺血再灌注损伤大鼠神经细胞凋亡及bcl-2,bax表达的影响。
       1   材料与方法
       1.1   动物老年Wistar大鼠40只，清洁级，雌雄各半，体质量（300±20）g，华中科技大学同济医学院实验动物学部提供，动物字号：TJLA-2003-111。
       1.2  药物与试剂愈风颗粒，以蒸馏水稀释为50%的水溶液（每毫升溶液含生药0.5 g）；尼莫地平片，以蒸馏水稀释为1%的水溶液（每毫升溶液含生药1 mg）；生理盐水。原位细胞凋亡检测试剂盒（TUNEL），大鼠bcl-2免疫组化染色试剂盒，bax免疫组化染色试剂盒，均由武汉博士德生物工程有限公司生产。
       1.3  分组大鼠随机分为4组：正常对照组（简称正常组）、造模对照组（简称模型组）、尼莫地平组（简称西药组）、愈风颗粒组（简称中药组），每组10只。
       1.4  造模按文献［1］方法造大鼠脑缺血再灌注模型。大鼠麻醉、固定，切开颈部分离出双侧颈总动脉，用小动脉夹夹闭双侧颈总动脉30 min，松开双侧颈总动脉夹造成再灌注60 min模型。正常组麻醉后颈部切开分离双侧颈总动脉，不夹闭。
       1.5  处理造模前30 min中药组给予愈风颗粒水溶液按5 g/kg体质量灌胃；西药组给予1%尼莫地平水溶液按10mg/kg体质量灌胃；模型组及正常组给予生理盐水按10 ml/kg体质量灌胃。每只大鼠灌胃1次。
       1.6  指标测定
       造模24 h后断头处死动物，快速取脑在冰皿上自嗅结节前缘4 mm处做冠状切片，厚度4 mm，立即放入4%多聚甲醛固定12 h，脱水，浸蜡，包埋后连续切片，厚度5 μm。脑组织原位细胞凋亡检测（TUNEL），bcl-2,bax阳性细胞的检测均由武汉博士德生物工程有限公司完成。
       1.7  统计学处理各组切片均用显微镜观察，以高倍镜（40×10）下观察5个视野，观察每个高倍视野下平均TUNEL，bcl-2,bax阳性细胞数。计数资料以±s表示，做F检验及Q检验，以P<0.05为有显著性差异。
       2   结果
       2.1  各组大鼠脑组织凋亡（TUNEL）阳性细胞数及百分率的比较见表1。由表1可见，模型组大鼠脑组织凋亡阳性细胞数及百分率显著高于正常组（均P<0.01）；中药组及西药组大鼠脑组织凋亡阳性细胞数及百分率显著低于模型组（均P<0.01），中药组与西药组间大鼠脑组织凋亡阳性细胞数及百分率无显著性差异（P>0.05）。表1  各组大鼠脑组织凋亡（TUNEL）阳性细胞数及百分率的比较（略）
       2.2  各组大鼠bcl-2,bax阳性细胞数及bcl-2/bax比值的比较见表2。从表2可见，模型组大鼠脑组织bax，bcl-2阳性细胞数显著高于正常组，bcl-2/bax比值显著低于正常组（均P<0.01）；中药组及西药组大鼠脑组织bax阳性细胞数显著低于模型组，bcl-2阳性细胞数及bcl-2/bax比值显著高于模型组（均P<0.01）；中药大剂量组大鼠脑组织bax、bcl-2阳性细胞数与西药组间无显著性差异（P>0.05）。表2  各组大鼠bcl-2,bax阳性细胞数及bcl-2/bax比值的比较（略）
       3   讨论
       愈风颗粒为自拟方药，由生大黄、水牛角等药组成，有通腑泄热、凉血解毒之功，主要用于急性期脑梗塞患者的治疗。近年来,越来越多的实验证明,脑缺血与细胞凋亡之间存在着密切的关系。郝氏等［2］研究发现脑细胞的凋亡于缺血再灌注后6 h开始增加，于24 h达高峰，于36 h有下降，凋亡细胞以缺血半暗带明显。说明缺血再灌注容易引起脑神经细胞的凋亡，是脑梗死脑损伤的机理之一。本研究结果表明，模型组大鼠脑组织TUNEL阳性数显著高于正常组，中药组及西药组大鼠脑组织TUNEL阳性数显著低于模型组，说明脑缺血再灌注急性期可诱发脑神经细胞凋亡，而愈风颗粒有明显的抗凋亡作用。
       bax基因、bcl-2基因均属于原癌基因bcl-2基因家族。其中bax促进细胞凋亡；而bcl-2能抑制细胞凋亡。Oltrai ZN等［3］研究发现细胞凋亡的发生与bcl-2/bax比值有关，比值高，细胞存活率高，比值低，则细胞凋亡率高。
       实验研究发现，模型组大鼠脑组织bcl-2，bax阳性细胞数显著高于正常，bcl-2/bax比值显著低于正常组；中药组及西药组大鼠脑组织bcl-2阳性细胞数显著高于模型组，bax阳性细胞数显著低于模型组，bcl-2/bax比值显著高于模型组。考虑为脑缺血再灌注损伤后bcl-2随细胞凋亡信号的启动而开始升高，正常组大鼠因凋亡水平很低，所以bcl-2表达不显著，而脑缺血再灌注损伤后bax在细胞接受凋亡信号后表达增加，发挥进一步凋亡信号传递过程，故在模型组显著升高。模型组大鼠神经细胞发生明显的凋亡，bcl-2表达有一定的升高。愈风颗粒显著上调bcl-2的表达，发挥明显的抗神经细胞凋亡的作用。模型组bcl-2/bax比值最低，所以发生明显的细胞凋亡，中药组bcl-2/bax比值最高，说明抑制细胞凋亡作用最明显。
       由此可知，急性期脑缺血再灌注损伤后有明显的神经细胞凋亡现象，而愈风颗粒有明显的抗凋亡作用，其作用机制可能与下调促凋亡基因bax水平，上调抗凋亡基因bcl-2水平，提高bcl-2/bax比值有关。
       【参考文献】
         　　［1］汪远金，申国明,王钦茂.川芎嗪对大鼠脑缺血再灌注损伤的保护作用［J］.安徽中医学院学报,2000，19(1):44.
       
       ［2］郝久宽，于维东，白抚生，等.大鼠局灶性脑缺血再灌注后Fas表达与细胞凋亡关系的研究［J］.脑与神经疾病杂志，2001，9（5）：272.
       
       ［3］Oltrai ZN,Milliman CL,Korsmeyeer SJ.Bcl-2 hyterodimenies in vivo with a conserved homology, Bax,that accelerate programmed cell death［J］.Cell,1998,74：609.