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       【摘要】 
       目的合成莪术醇全抗原并加以鉴定。方法先用莪术醇与琥珀酸酐为原料，以三氯甲烷为溶剂，4-二甲基氨基吡啶(DMAP)作催化剂，反应合成半抗原莪术醇琥珀酸单酯，然后，用1-乙基-3（3-二甲基氨基丙基）碳二亚胺法将莪术醇琥珀酸单酯偶联到牛血清白蛋白，合成了莪术醇的人工抗原，并用激光解析飞行质谱（MALDI-TOF-MS）进行了鉴定，利用质谱特征求得了偶联物中莪术醇与牛血清白蛋白的量，计算出结合比。结果成功地合成了莪术醇人工抗原，其结合比为19.6。结论用1-乙基-3（3-二甲基氨基丙基）碳二亚胺偶联法可合成莪术醇的完全抗原。
       【关键词】  莪术； 莪术醇； 1-乙基-3（3-二甲基氨基丙基）碳二亚胺； 人工抗原； 莪术醇琥珀酸单酯
       Synthesis and Identification of Artificial Antigen for Curcumol，An Antitumor Compounds from Rhizoma Zedoariae
       YANG Xinping, CHEN Xu, LI Fangyao, RUAN Fang, LIN Jiaxun, ZHONG Haiyan
       1. School of Pharmacology, Guilin Medical University,Guilin 541004,China； 2.Central South University of Foresty and Technology，Changsha 410004，China
       Abstract：ObjectiveTo synthesize and identify the artificial antigen of curcumol.MethodsFirstly，a hapten of curcumol, curcumol-hemisucinate(Cur.-HS) was synthesized  using material of curcumol to react with succinic anhydride in chloroform and trace 4-dimethylaminopyridine(DMAP) as catalyst. Then the hapten was conjugated to bovine serum albumin(BSA) using 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide,(EDC) method and the characterization of the antigen was examined by MALDI-TOF-MS, and the conjugation ratio of curcumol to BSA was determined with MALDI-TOF-MS. ResultsThe artificial antigen was successfully synthesized and identified by MALDI-TOF-MS. The conjugation ratio of curcumol to BSA was 19.6. ConclusionThe artificial antigen of curcumol is successfully synthesized by EDC method.
       Key words：Rhizoma Zedoariae；  Curcumol；  EDC；  Antigen；  Curcumol-hemisucinate
       
       莪术是姜科植物蓬莪术Curcum a phaeocaulis Val.、广西莪术Curcuma kwangsiensis S.G.. Lee et C.F.Liang或温郁金Curcuma wenyujin Y. H. Chen et C.Ling的干燥根茎，后者习称“温莪术”。中医理论认为莪术辛、苦、温，归肝、脾经，具行气破血，消积止痛之功效［1］。莪术醇（Curcumol），又名姜黄环醇，是从莪术挥发油中提取出来的倍半萜类化合物，莪术醇是莪术油中有效成分之一，其药理作用主要集中在抗癌，抗菌和抗病毒等方面；莪术醇可作为莪术及莪术油质量评价依据之一［2］；目前检测莪术醇的方法主要有比色法、红外分光光度法、双波长薄层扫描法、气相色谱法［3］。比色法特异性不强，易受其他因素的影响；后几种仪器检测法都需要特定的仪器，对测定样品的前处理复杂，检测成本高，均不适合大批量样品的精确测定，故需要一种高效、快速、便捷的检测方法。
        
       基于抗原抗体反应的酶联免疫吸附测定（enzyme-linked immuno sorbent assay，ELISA）具有快速、特异性强、灵敏度高、操作简便，本法适合大规模检测，已被广泛应用于农药、激素及其他化学污染物、残留物的检测；国内外有文献报道用该法研究药用植物中活性成分［4～10］，同时显示了该技术的许多优点和用途。莪术醇酶免疫吸附测定方法的建立在药物研发过程中药代动力学的研究及天然资源的筛选，药物生产过程中（包括种植、组织培养）的在线监测、药品流通和使用过程中批量样品的质量检测等方面有着广阔的应用前景。应用ELISA法必须有相应的抗体，莪术醇是小分子半抗原，本身不具有诱导产生抗体的能力，为此须将莪术醇小分子以半抗原的形式与相对分子量大的载体蛋白偶联制备成全抗原。
        
       本实验以莪术醇和琥珀酸酐为原料，在4-二甲基氨基吡啶（DMAP）催化下，先合成半抗原莪术醇琥珀酸单酯（Cur.-HS），再用1-乙基-3（3-二甲基氨基丙基）碳二亚胺（EDC）缩合法将Cur.-HS与牛血清白蛋白（bovine serum albumen，BSA）偶联，合成人工抗原Cur.-HS-BSA，应用基质辅助激光解吸电离-飞行时间-质谱（MALDI-TOF-MS）技术对上述复合物进行了鉴定并计算出结合比，为莪术醇单克隆抗体的制备及酶联免疫吸附测定法的建立打下了基础。
       1  仪器与材料
       1.1  仪器透析袋（华美生物工程公司，Sigma公司进口分装）、超导核磁共振仪(AVANCE AV 500，Bruker)、质谱分析仪（SHIMADZU QP5050A，日本）、基质辅助激光解吸飞行时间质谱仪（JMS－ELITE，日本JEOL公司）、微量移液枪（德国普兰德）、电子天平（CP225D，北京赛多利斯仪器系统有限公司）、集热式恒温磁力搅拌仪（DF-101S  巩义市英裕予华仪器厂）。
       1.2  药品莪术醇（上海沪云医药开发有限公司，批号：CC070518，98%HPLC）、丁二酸酐（CP,中国医药集团上海化学试剂公司）、牛血清白蛋白（BSA，RIA级）（Sigma公司）、1-乙基-3（3-二甲基氨基丙基）碳二亚胺（EDC）（Sigma）、4-二甲基氨基吡啶（DMAP）、吡啶、乙醚、三氯甲烷、石油醚、醋酸乙酯、乙腈、三氟醋酸（TFA）、芥子酸，均为分析纯。
       2  方法与结果
       2.1  莪术醇琥珀酸单酯（Cur.-HS）合成［11］和鉴定取10 ml 三氯甲烷置于反应瓶，加入少量无水MgSO4，搅拌过夜，滤除去MgSO4，取滤液，加入莪术醇0.117 0 g（0.495 mmol）、丁二酸酐0.12 g（1.2 mmol），搅拌溶解，加入适量DMAP，于65℃回流，TLC监测反应进度，反应结束，冷却，将反应物倾入冰水中，用乙醚萃取，合并有机相，用无水Na2SO4干燥后，回收有机溶剂，得粗品，用硅胶柱层析（石油醚－乙酸乙酯＝8∶1，V/V），得纯度较高的莪术醇丁二酸单酯油状物0.145 0 g，产率87％。
       
       莪术醇13C-NMR：δ12.34，21.46，23.04，28.71，30.92，38.84，39.39，54.50，56.33，88.09，104.53，112.82，144.76。莪术醇琥珀酸单酯MS（APCI）m/z：337.14(M-)；13C-NMR：δ11.62，20.90，22.21，28.71，29.13，30.2，30.80，39.12，52.58，54.35，89.33，108.67，112.51，144.83，169.15，172.55。
       2.2  莪术醇人工抗原的合成［12］Cur.-HS-BSA合成：称取4.15 mg（12.3×10-6mol）莪术醇丁二酸单酯，加吡啶∶H2O（1∶1,V/V）溶液250 μl，搅拌溶解；称取BSA 2.8 mg，加入碳酸钠缓冲液250 μl，搅拌溶解，加入EDC 4.7 mg（24.6×10-6 mol），将莪术醇丁二酸单酯的吡啶水溶液加入前反应液中，于室温反应15 h。装入透析袋，用纯净水于4℃透析，每5 h换水1次，透析3 d，经冷冻干燥，得1.60 mg Cur.-HS-BSA，产率52％。于-20℃下保存。
       2.3  利用MALDI-TOF-MS鉴定莪术醇人工抗原
       2.3.1  基质辅助溶液的配制将0.15％三氟醋酸（TFA）666 μl加到乙腈（CH3CN）333 μl 中，取10 mg芥子酸加入前配0.15％TFA-CH3CN混合液1 μl，超声10～15 min后溶解，备用。
       2.3.2  供试品处理取Cur.-HS-BSA，溶解在8 mol/L的尿素溶液中，然后将其稀释成浓度在1～10 pmol/L；另称取BSA 0.5 mg溶于水100 μl，配成5 mg/ml BSA水溶液。
       2.3.3  MALDI-TOF-MS测定各取供试品和基质辅助溶液1 μl，充分混匀，吸取混合溶液1 μl滴加在镀金样品板上，室温下晾干后，送入质谱仪分析。
        
       结合比＝（偶联物相对分子质量－蛋白质相对分子质量）/莪术醇相对分子质量
        
       结合比＝（73 302.3－66 713.4）/336.42＝19.6
       2.4  莪术醇琥珀酸单酯（Cur.-HS）结构的确定用MS谱和13C-NMR谱确定Cur.-HS的结构。从Cur.-HS的MS（APCI）m/z：337.14（M-），推出其分子量为336，初步认为Cur.-HS为合成的目标产物；再分别测出原料莪术醇、Cur.-HS的13C-NMR谱，比较Cur.-HS的13C-NMR与原料莪术醇的13C-NMR不同，发现产物多出δ172.48，169.15，30.2，29.13，共4条谱线，其中δ169.15为莪术醇成丁二酸单酯后酯羰基碳原子，δ172.48为莪术醇成丁二酸单酯链羧基羰基碳原子，而δ29.13，δ30.2，为丁二酸单酯链中的2个亚甲基碳原子。结合MS的数据，对原料莪术醇和合成出的产物的碳谱的化学位移数据的差异分析表明，从而确定合成出的产物就是所要合成的目标产物Cur.-HS。
       2.5  Cur.-HS-BSA的MALDI-TOF-MS分析根据MALDI-TOF-MS图谱（见图1～2），可以清晰地判断出Cur.-HS与BSA偶联形成了新的复合物，该复合物的相对分子质量约为73 302；对比BSA的相对分子质量（66 713）以及Cur.-HS的相对分子质量（336）,可以求出Cur.-HS-BSA的结合比为19.6，本实验中人工合成的半抗原-蛋白复合物Cur.-HS-BSA的结合数值较大，每个载体蛋白分子平均与19.6个半抗原分子结合，说明半抗原与载体的偶联情况良好，这为后续的抗Curcmol抗体的制备提供了可靠的试验基础。
       3  讨论
           
       莪术醇为小分子天然化合物，相对分子量236.35，仅具有反应原性，需要与大分子蛋白质等偶联形成复合物后才有免疫原性，但小分子化合物必须具有或衍生出能与载体进行交联反应的功能基团（如氨基、羧基、重氮基等），才能与载体交联；对含羟基的半抗原，需要将其羟基衍生为羧基再与蛋白质载体交联合成人工抗原。根据莪术醇结构中存在C6羟基的特点，先将莪术醇与琥珀酸酐反应，接上一个琥珀酸臂成中间体Cur.-HS，从而在C6位羟基上引入一个羧基，进而与BSA的氨基通过酰胺键相连，生成Cur.-HS-BSA 蛋白复合物。
        
       Cur.-HS的合成条件较温和，在DMAP催化下产物很容易得到，且产率较高。将含羧基的半抗原与蛋白质载体偶联常采用混合酸酐法、活泼酯法或碳化二亚胺法。本实验用EDC作缩合剂，Cur.-HS和BSA交联形成抗原的反应条件较温和，在常温下就能进行。
       目前对人工合成抗原多采用物理化学方法对其进行鉴别，主要有紫外光谱法、红外光谱法、核磁共振法、质谱法等。本实验利用生物质谱MALDI-TOF-MS技术来鉴定出Cur.-HS-BSA 蛋白复合物，分别测出Cur.-HS-BSA 和BSA的相对分子质量，通过对BSA和Cur.-HS-BSA相对分子质量的比较，确定Cur.-HS与BSA偶联成功。
        
       由于人工抗原中载体蛋白上连接的半抗原数目即结合比常常影响抗体的产生，因此在免疫前测定合成的人工抗原载体上连接的半抗原数目是非常必要和重要的。据文献［13，14］制备抗原的经验，结合比通常在3及以上时有较好的应用价值，能成功地用于后续的免疫操作，获得相应的单抗产物。本实验中通过MALDI-TOF-MS测定出的BSA和Cur.-HS-BSA的相对分子质量，计算出了Cur.-HS-BSA的结合比为19.6，说明半抗原与载体的偶联情况良好，已能满足动物免疫实验的要求，可用来进行后续的免疫操作。
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