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       【摘要】 
       目的观察紫草总酚酸辅助米非司酮对妊娠小鼠的抗早孕及对妊娠小鼠离体子宫肌条的收缩作用。方法对妊娠昆明种小鼠于妊娠第6～8天给药，共8组，每组10只,观察妊娠抑制率；用放射免疫法测定血清中孕酮的水平。建立离体子宫平滑肌装置，研究紫草总酚酸对孕龄5～10 d的受孕小鼠的离体子宫平滑肌的作用。结果用小鼠口服紫草总酚酸1 040 mg·kg-1能够显著性的提高单用米非司酮（1.5 mg·kg-1）的妊娠抑制率（P<0.05），并能增加实验组平均死胎数，但是对血清孕酮的水平没有明显的影响（P>0.05）。紫草总酚酸有显著增强早孕小鼠离体子宫平滑肌条的收缩活性的作用（与给药前比较P<0.01）。结论紫草总酚酸辅助米非司酮对妊娠小鼠的抗早孕作用明显，其抗早孕作用不是通过降低孕酮水平来实现的。紫草总酚酸可显著增强早孕小鼠离体子宫平滑肌条的收缩活性。
       【关键词】  紫草总酚酸； 小鼠； 抗早孕； 子宫肌条
       Effects of Phenolic Acids from Arnebia euchroma (Royle.) Johnst Assist  Mifepristone on Earlypregnancy of Mice and  the Contractile Activity of Isolated Uterine Smooth Muscle
       WANG Lijun, ZHANG Xinyi, LIAO Maochuan
       1.South-central University for Nationalities, Hubei Wuhan 430074,China; 2.Shanghai Insitute of Planned Parenthood Research, Shanghai 200032,China
       Abstract:ObjectiveTo observe the effect of phenolic acids from Arnebia euchroma assist  Mifepristone  in  anti-Earlypregnancy of mice and the  effect  of  the phenolic acids on contractile activity of isolate uterine smooth muscle strips in gravid rats.Methods The  mice with phenolic acids during the 6th to 8th days, and the restaining rate of  pregnancy was observed. At the  same  time, the progesterone  level in blood serum was deseruined by radioimmunoassay. The equipment of  isolate uterine smooth muscle was used to study the effect of the phenolic acids on  isolate uterine smooth muscle strips in gravid rats that has been  pregnancy  for 5～10days  .Results1040 mg/kg phenolic acids could  markedly increase  the restaining rate of  pregnancy(P<0.05)  induced by Mifepristone dose (1.5 mg·kg-1).In addition ,the number of everage still birth increased, however , to the the progesterone  level in blood serum  ,it has little effect .(P>0.05). The phenolic acids had a marked  effect on contractile activity of isolate uterine smooth muscle strips in gravid rats.ConclusionThe  effect of  the phenolic acids assist Mifepristone in  anti-Earlypregnancy of mice is clear which is not relevant to the decrease of progesterone  level phenolic acids has a marked  effect on contractile activity of isolated uterine smooth muscle strips in gravid rats.
       Key words:Phenolic acids from Arnebia euchroma;  Mice;  Anti-earlypregnancy；  Uterine smooth muscle strips
       
       新疆紫草Arnebia euchroma (Royle) Johnst.为常用中药，具有凉血、活血、解毒透疹的功能；用于血热毒盛、斑疹紫黑、麻疹不透、疮疡、湿疹、水火烫伤。在国家高技术研究发展计划（863计划）资助下，张慧桢等［1］全面系统地进行了新疆紫草酚酸类化合物有效部位的化学成分、制备工艺、质量标准及辅助药物流产药理作用［2］的研究。本文报道紫草总酚酸辅助米非司酮对妊娠小鼠的抗早孕及对妊娠小鼠离体子宫肌条的收缩作用。
       1  材料与仪器
       1.1  药物米非司酮，由上海市华联制药有限公司提供，25 mg/片（不包括辅料量）， 批号20010510， 用1%的羧甲基纤维素钠制成混悬液备用。紫草总酚酸，棕褐色颗粒, 酚酸含量57%，由上海市计划生育科学研究所国家计划生育药具重点实验室提供，批号20011216，用蒸馏水溶解，配成260 mg·ml-1,4℃冰箱保存。低钙任-洛氏营养液，NaCl 153.8 mmol·L-1( 分析纯,上海建信化有限公司试剂厂,批号20001114)，KCl  5.77 mmol·L-1( 化学纯, 上海化学试剂总厂试剂一厂,批号20001213)，NaHCO3  5.95 mmol·L-1(化学纯, 上海虹光化工厂,批号 20010213)，CaCl2 0.54 mmol·L-1(分析纯 , 金山县兴塔化工厂,批号20010314)，葡萄糖 16.7 mmol·L-1(分析纯, 上海化学试剂分装厂,批号 20001019)。缩宫素：上海禾丰制药有限公司，10 u·ml-1)，用蒸馏水配制成1 u/ml浓度。
       1.2  动物成年,未孕昆明种雌性小鼠(体质量为25～30 g),由上海医科大学实验动物中心供应，清洁级，动物合格证：02-22-1。动物饲养于上海市计划生育科学研究所实验动物房，人工昼夜，室温（20±2）℃，相对湿度65%～70%。
       1.3  仪器Olympus CX41-32C02 光学显微镜,日本产品。501型超级恒温器，上海市实验仪器厂产品。麦氏浴槽，型号 MYC，上海中胜科教设备有限公司产品。张力换能器，型号XJZ-3，上海中胜科教设备有限公司产品。生物信号处理系统，型号SMUP-PC，上海市嘉龙教仪厂产品。
       2  方法
       2.1  辅助米非司酮对妊娠小鼠的抗早孕作用
       2.1.1  受孕选用体质量26～30 g处于动情期或动情前期的雌鼠与同种雄鼠按照雌雄2∶1合笼交配,每天清晨8：00～9：00检查阴道有无阴栓,无阴栓的小鼠做阴道涂片，显微镜下观察有无精子，将查到阴栓者或显微镜下查到精子者作为妊娠第1天, 雌、雄鼠2周交配不成功者剔除［3］。取妊娠小鼠80只,随机分成7个实验组和1个正常对照组，每组10只。
       2.1.2  分组与给药单用米非司酮组：妊娠第6，7，8日上午9：00～10：00灌胃给药1.5 mg·kg-1米非司酮；单用紫草总酚酸低、中、高剂量组：于妊娠第6，7，8日上午9：00～10：00分别灌胃给药紫草总酚酸260，520，1 040 mg·kg-1；米非司酮+紫草总酚酸低、中、高剂量合用组：妊娠第6，7，8日上午9：00～10：00灌胃1.5 mg·kg-1米非司酮，妊娠第6，7，8日下午15：00～16：00分别灌胃260，520，1 040 mg·kg-1的紫草总酚酸；正常对照组灌胃同体积蒸馏水。
       2.1.3  一般观察各实验组均于妊娠第12天解剖，检查子宫内胚胎情况，剪取两侧子宫称重，计算死胎活胎数和各实验组的平均死胎数，统计给药组妊娠抑制率，与对照组比较有无统计学差异。
       2.1.4  指标检测各实验组的小鼠于妊娠第12天断头取血，按RIA法测定血清中孕酮的含量。
       2.1.5  统计检验采用医学统计软件PEMS3.1进行统计处理，各项数值均用±s标准差表示，妊娠抑制率用卡方检验，子宫重量和孕酮含量采用excel进行t检验。
       2.2  对妊娠小鼠离体子宫肌条的收缩作用
       2.2.1  预处理浴槽中放置洛氏液22 ml，水温控制在(37±0.5)℃，记录仪灵敏度调至1 g。受孕5～10 d左右雌性小鼠在实验前两天，用雌二醇20 μg/10 g，腹腔注射，每隔24 h注射1次。实验当天，将小鼠颈椎脱臼处死，割腹取出子宫立即置于盛有低钙任-洛氏液的玻璃平皿中,轻柔剥离附着于子宫壁上的结缔组织和脂肪组织,将一侧子宫角的两端分别用线结扎，两线间距0.8～1.0 cm,置于浴槽内（20 ml）,子宫角标本一端和通气钩相连，另一端与张力换能器接入端上钩子相连，静息张力调至1.0 g。
       2.2.2  正常子宫肌张力检测标本在浴槽内低钙任-洛氏营养液中稳定35 min,同时通以95%O2+5%CO2混合气体,工作温度30～32℃,其间每隔15 min更换低钙任-洛氏营养液1次，后1次更换液后5 min,记录正常的子宫肌张力。
       2.2.3  加缩宫素子宫肌张力检测将1 u/ml缩宫素0.1 ml加入浴槽（此时药物浓度为5×10-3 u/ml）,观察及记录平滑肌张力的变化，记录到最大值时，稳定5 min后，用低钙任-洛氏营养液洗涤３次，让子宫肌条重新稳定到加药前的基线。
       2.2.4  加紫草总酚酸子宫肌张力检测按“2.2.3”操作，药物的浓度均为50 mg/ml，给药量为0.1 ml，加药后观察的时间为5 min，观察并记录结果，总共做１０个样本。
       2.2.5  检测指标收缩强度（mm）:5 min内各次收缩最高点均值；收缩频率：5 min内收缩次数；收缩活性：5 min 内收缩强度与收缩频率的乘积。
       2.2.6  统计检验采用医学统计软件PEMS3.1进行统计处理，各项数值均用±s表示, 统计分析用配对计量资料检验和t检验，显著性水平取P=0.05和0.01。
       3  结果
       3.1  紫草总酚酸辅助米非司酮对妊娠小鼠的抗早孕作用
       3.1.1  肉眼观察对照组小鼠妊娠子宫直径粗，淡红色，呈结节状，表面光滑而有光泽，胚胎发育良好，呈密集串珠状。米非司酮组小鼠出现不完全流产，子宫直径比对照组细，呈暗红色，有淤血现象。单纯紫草总酚酸低剂量组小鼠的子宫类似对照组的子宫，但直径较细，结节状，部分胚胎出现淤血，其余胚胎发育良好；单纯紫草总酚酸中剂量组和高剂量组小鼠的子宫出现不完全流产，子宫直径较对照组细，呈暗红色，个别子宫甚至出现完全流产，胚胎有坏死淤血现象。米非司酮+紫草总酚酸低剂量组的小鼠大部分出现完全流产，其子宫直径与对照组相比较明显减小，暗红色，结节不明显，表面光泽差，胚胎无或发育差，有淤血坏死现象。米非司酮+紫草总酚酸中剂量组的小鼠大部分完全流产，无结节状膨大，子宫血管增生，呈灰红色。米非司酮+紫草总酚酸高剂量组小鼠全部出现完全流产，子宫直径细，无结节状膨大，无胚胎，呈灰白色。
       3.1.2  病理组织学检查正常对照组胚胎发育正常，单用中药组胚胎基本发育正常；米非司酮组胚胎细胞形态结构有轻微紊乱和萎缩，底蜕膜表面出血，部分细胞有异形，蜕膜出血；合用药组囊胚内细胞团部分细胞空泡变，表面有出血坏死，可见少量异形细胞。
       3.1.3  各实验组的妊娠抑制率和平均死胎数和对照组相比较米非司酮组的妊娠抑制率与对照组相比较有显著性差异(P<0.05);紫草总酚酸低剂量组、紫草总酚酸中剂量组和紫草总酚酸高剂量组的妊娠抑制率与对照组相比较均无显著性差异(P>0.05);米非司酮+紫草总酚酸低、中、高剂量组的妊娠抑制率与对照组相比较均有非常显著性差异(P<0.01)。米非司酮+紫草总酚酸高剂量组的妊娠抑制率与米非司酮组相比较也有显著性差异(P<0.05)。紫草总酚酸单用组即可使得部分胚胎死亡，紫草总酚酸与米非司酮合用时则能使得平均死胎数增加，平均死胎数增加的程度随着紫草总酚酸剂量的增加而增加。
       3.1.4  各实验组的子宫重量的变化与对照组相比较米非司酮组、紫草总酚酸中剂量组和高剂量组的子宫重量均显著性减轻(P<0.05),而紫草总酚酸低剂量组子宫重量与对照组相比较没有显著性差异（P>0.05）;米非司酮+紫草总酚酸低、中、高各实验组的子宫重量与对照组相比较非常显著性减轻（P<0.01）;米非司酮+紫草总酚酸中剂量组和米非司酮+紫草总酚酸高剂量组与单用米非司酮组的子宫重量也有显著性减轻（P<0.05）。见表1。表1  紫草总酚酸辅助米非司酮对妊娠小鼠的抗早孕作用（略）
       3.1.5  各实验组的孕酮含量与对照组相比较均无显著性差异（P>0.05），表明米非司酮、紫草总酚酸以及两药合用对孕酮水平均无明显影响。见表2。表2  紫草总酚酸对妊娠小鼠孕酮含量的影响（略）
       3.2  紫草总酚酸对早孕小鼠离体子宫平滑肌条收缩的影响用药后紫草总酚酸（50 mg·ml-1，0.1 ml）早孕小鼠离体子宫平滑肌条的收缩强度和收缩活性有非常显著的增加（P<0.01）。见表3。表3  紫草总酚酸对早孕小鼠离体子宫平滑肌条收缩的影响（略）
       4  讨论
           
       国内外使用米非司酮与不同的前列腺素的配伍仍存在7%～10%的不完全流产率和失败率［5］，因此提高药流疗效仍十分重要。有研究表明紫草可在一定的程度上提高药物的完全流产率和缩短出血时间［4］。我们使用紫草总酚酸辅助米非司酮对小鼠进行抗早孕实验，发现紫草总酚酸辅助米非司酮对小鼠的早孕有极强的抑制作用，1 040 mg·kg-1的紫草总酚酸辅助小剂量的米非司酮（1.5 mg·kg-1）即可使得动物全部流产。
        
       孕酮在妊娠早期主要由妊娠黄体分泌，因此孕早期的变化并不十分明显，孕酮在孕早期略有增加。孕酮含量的维持与变化对于胚胎是十分重要的，而米非司酮主要是作用于子宫内膜和蜕膜，与孕酮竞争结合受体，使孕酮与其受体正常作用受到干扰，从而抑制孕酮的活性，破坏了胚胎生长的条件，使妊娠不能维持。我们在实验中发现各实验组的孕酮含量并没有明显的变化，因此其抗早孕作用不是通过降低孕酮水平来实现的，有实验表明，紫草对血清中的垂体生殖激素有明显的抑制作用［5］，是否与紫草总酚酸辅助米非司酮抗早孕作用有关有待进一步研究。
        
       针对药流中不完全流产由于绒毛或滋养细胞残留，蜕膜细胞排出缓慢所致的原因，我们研究了紫草总酚酸对离体子宫平滑肌的作用，实验表明，紫草总酚酸有非常显著增强早孕小鼠离体子宫平滑肌条的收缩活性的作用（与给药前比较P<0.01）。其对小鼠离体妊娠子宫的收缩作用主要是通过增加离体小鼠妊娠子宫的收缩强度来实现的，最终使早孕胎盘排出体外，可能是其抗早孕的药理依据之一。
       【参考文献】
         　　［1］张慧桢, 廖矛川, 宣利江,等.新疆紫草中抗生育化学成分(英文)［J］.天然产物研究与开发, 2002,14(1)：1.
       
       ［2］王丽君，张鑫毅，廖矛川.紫草总酚酸辅助米非司酮对妊娠大鼠的抗早孕作用［J］.中国中药杂志，2008，33（20）：2378.
       
       ［3］徐叔云，卞如濂，陈 修. 药理实验方法学，第3版［M］.北京：人民卫生出版社,2002：1572.
       
       ［4］刘建华，法韫玉. 紫草辅助米非司酮抗早孕对生殖激素的影响［J］.生殖医学杂志,2000，9（3）：155.
       
       ［5］马保华，王哲民.中药紫草抗生育作用的研究［J］.山东医科大学学报,1993，3：34.