文章标题 全文   多个检索词，请用空格间隔。

       【摘要】 
       目的采用新型的连续加碱法制备水溶性羧甲基壳聚糖，并对合成工艺进行优化。方法以壳聚糖、氯乙酸为原料，苄基三乙基氯化铵(TEBA)为催化剂，采用连续加碱法制备羧甲基壳聚糖，考察催化剂使用量、反应温度、反应时间和投料比对羧甲基壳聚糖取代度(DS)和溶解性的影响。结果最佳反应条件为:以6%的苄基三乙基氯化铵作催化剂，m(壳聚糖)：m(氯乙酸)为1∶5，反应温度90℃，反应时间5h时，羧甲基壳聚糖的取代度（DS）和溶解率分别达到1.35和99.10%。结论本法制备的羧甲基壳聚糖具有优越的水溶性能,是一种制备羧甲基壳聚糖的有效方法。
       【关键词】  羧甲基壳聚糖； 连续加碱法； 絮凝剂； 氯乙酸
       New Process for Synthesis of Novel Flocculant ——Carboxymethyl Chitosan and its Characterization
       XIAO Yuliang, DUAN Guiyun，LI Furong, XIA Chengcai, YOU Guirong, HAN Junfen，GUO Fengguang
       Pharmacological Sciences of Taishan Medical University， Taian 271000, China
       
       Abstract：ObjectiveTo prepare water soluble carboxymethyl chitosan by a new kind of continuous alkali-feeding method, and to optimize its synthetic conditions. MethodsWith chitosan and chloroacetate as the reactants and triethyl- benzylammonium (TEBA) as catalyst, carboxymethyl chitosan(CMC) was synthesized by continuous alkali-feeding method. The effects of carboxymethylation conditions on the degree of substitution(DS) and solubility of CMC were studied. ResultsThe optimum conditions were as follows：6% triethylbenzylammonium (TEBA) as catalyst, reaction temperature was 90℃,reaction time was 5 h and weight ratio of chitosan to chloroacetic acid was 1∶5, the substitution (DS) and the rate of solubility reached 1.35 and 99.10%, respectively. ConclusionThe product has superior water-soluble property，and the continuous alkali-feeding method is for the synthesization of CMC.
       Key words： Carboxymethyl chitosan (CMC)； Continuous alkali-feeding method ；Flocculant；Chloroethanic acid
        壳聚糖是自然界储量极丰富的天然高分子多糖，壳聚糖具有优良的生物相容性和生物可降解性，其分子中丰富的带电基团如氨基、羟基以及长链分子结构，可通过“吸附架桥”和“电中和”作用除去中药原液中较大的悬浮颗粒,利用天然胶体保护作用使制剂澄清并较多地保留药液中的成分，是一种优良的中药药液絮凝剂［1,2］。但是由于壳聚糖只能溶解于酸和酸性水溶液中，在很大程度上限制了它在中药药液絮凝剂领域的应用。因此，对壳聚糖进行化学改性以提高其在水及有机溶剂中溶解性的研究，具有重要意义。羧甲基壳聚糖(CMC)是壳聚糖羧甲基化后的产物，由于它既保留了壳聚糖的优点，又极大地改善了水溶性、絮凝性,更适合于现代中药药液絮凝剂的要求。
       传统的羧甲基壳聚糖制备方法，反应时间长，碱液浓度高，酸碱用量大，对环境污染严重［3］。因此，对CMC可控制备方法、影响取代度因素及相关规律的研究显得非常重要。目前这方面的文献报道较少，基于此，本文拟采用连续加碱法控制羧甲基壳聚糖制备过程中碱的用量，并对催化剂的用量、反应温度、反应时间及投料比等影响因素进行系统的研究，以期为可控制备不同取代度CMC提供依据，找到适合中药药液絮凝的羧甲基壳聚糖的制备条件，为壳聚糖这一宝贵资源的在中药药液絮凝领域开发利用提供技术支持。
       1  材料与仪器
       壳聚糖(脱乙酰度大于90%，粘度50-80cps国药集团化学试剂有限公司);TEBA(三乙基苄基氯化铵、化学纯，天津市光复精细化工研究所)；氯乙酸（分析纯、天津市化学试剂一厂）；其它试剂均为分析纯。PHS-29A pH计，上海精科；岛津IR-440型红外光谱仪；EDAX1900型光电子能谱仪，美国PHI公司。
       2  方法
       2.1  羧甲基壳聚糖的制备取2 g壳聚糖加到三口圆底烧瓶中,氯乙酸溶解在100 ml水中,用碱液中和转变成钠盐并略显碱性,然后和TEBA一起加到烧瓶中搅拌,在给定温度下反应一定时间,在反应过程中体系返酸时,不断滴加碱液,使溶液的pH值保持弱碱性。反应结束后, 向反应混合物中加入100 ml H2O,用冰乙酸调节溶液pH值约7,充分搅拌,离心分离后,收集上层澄清液,边搅拌边加入约2倍量的无水乙醇进行沉淀,待沉淀完全后,抽滤,滤渣用无水乙醇洗涤2次,除去产品表面上的水分,置60℃的烘箱内真空干燥,得白色颗粒状固体。
       2.2  取代度（DS）的测定电位滴定法［4］。
       2.3  溶解率的测定称取0.300 0 g干燥至恒重的羧甲基壳聚糖于50 ml的纯水，搅拌15 min，5 000 r/min下离心，未溶解的羧甲基壳聚糖60℃真空干燥10 h，恒重，计算溶解率,观察羧甲基壳聚糖的水溶性。
       溶解率（%）=溶于水的羧甲基壳聚糖质量羧甲基壳聚糖产品质量×100%
       2.4  红外光谱分析样品60℃真空干燥至恒重后，采用溴化钾压片法在IR-440型红外光谱仪上测试。
       2.5  X 射线衍射分析样品60℃真空干燥至恒重，研磨，过320目筛后，在EDAX1900型光电子能谱仪上测试，测试条件：范围4～40℃，扫描速度4°/min，CuKa辐射，管压35 Kv，管流35 mA。
       3  结果与讨论
       3.1  投料比对壳聚糖羧甲基化的影响以6%的TEBA为催化剂，在85℃的条件下，反应6 h，考察壳聚糖与氯乙酸质量比对反应的影响，结果如图1所示，从图中可以看出,随着投料比的增加,所得羧甲基壳聚糖的取代度与溶解率均先增大后减小。投料比为1∶5时,所得产品质量较好，其取代度可达到1.27，溶解率达到98.10%，因此取1∶5为最佳的反应配比。壳聚糖的羧甲基化反应主要包括两种反应 ：一是氯乙酸与碱的中和及水解反应(副反应)；二是氯乙酸钠与碱化壳聚糖的反应。氯乙酸用量增加，发生羧甲基化反应的几率增加，导致 DS上升，但当氯乙酸含量增加时过量氯乙酸中和了部分 NaOH，反应介质碱性减弱，不利于壳聚糖碱化 ，使其羟基钠盐活性中心减少，DS也随之下降；当氯乙酸用量过高时，反应体系变为酸性，羧甲基化反应不能进行。此外由于碱和氯乙酸间的中和反应和水解反应过程都要放热，如果将NaOH一次加入，副反应十分激烈，很难控制反应温度，而且氯乙酸利用率降低。为此采用连续加入NaOH的方法 ，可有效地提高反应效率。
       3.2  温度对壳聚糖羧甲基化的影响以6%的TEBA为催化剂，投料为1∶5的条件下，反应6h,考察温度对反应的影响，结果如图2所示，从图中可看出随着温度的增加,所得羧甲基壳聚糖的取代度与溶解率均先增大后减小。这说明温度升高,加快了壳聚糖的羧甲基化反应,取代度升高,当温度达到90℃后,取代度反而会降低。这是因为温度过高增加了氯乙酸钠的水解副反应,降低了取代度;温度的升高会使羧甲基壳聚糖分子链发生降解,产品颜色发黄。因此,最佳反应温度为90℃,所得产品取代度为1.32，而溶解率为98.6%。反应温度是制备高取代度羧甲基壳聚糖的一个很重要的因素，文献［5～7］中制备羧甲基壳聚糖通常在30%～50%浓碱溶液中对壳聚糖进行羧甲基化反应,由于碱浓度高,反应温度如果高于70℃,氯乙酸钠和浓碱的水解反应成为主反应,降低羧甲基化率。对于连续加碱法,由于氯乙酸钠不易水解,可以在更高温度下进行羧甲基化,可大大促进反应,因而能制备高取代度的羧甲基壳聚糖。
       3.3  反应时间对壳聚糖羧甲基化的影响以6%的TEBA为催化剂，在90℃，投料比为1∶5的条件下，考察反应时间对反应的影响，结果如图3所示，由图中可看出随反应时间延长,取代度和溶解率均增加。在最初5 h内,取代度有较大提高,反应5 h后,取代度增加幅度减小,变化平缓,表明羧甲基化反应基本在5 h内完成;时间过长会增加副反应，影响收率及质量,因此反应时间以5 h较适宜,此时产品的取代度为1.33，溶解率为98.9%。
       3.4  催化剂用量对壳聚糖羧甲基化的影响在投料比为1∶5，90℃的条件下, 分别加入壳聚糖质量分数的3%，4%，5%，6%，7%的TEBA催化剂,反应5 h,考察催化剂用量对羧甲基反应的影响,结果如图4所示，由图中可看出取代度和溶解率随催化剂用量的增加先增加后降低,当催化剂用量为壳聚糖质量分数的6%时,产物的取代度最高。这主要是因为催化剂用量较低时，相转移催化剂的转移能力有限，随使用量的升高，转移速率加快，增大了C1CH2COONa与反应中心的有效碰撞几率，加快了壳聚糖的羧甲基化反应，使产物取代度DS较高，但催化剂量继续增加，C1CH2COONa水解副反应也会增强，故最适宜的催化剂用量为壳聚糖质量分数的6%,此时产品的取代度为1.35，溶解率为99.1%。
       3.5  最优条件下羧甲基壳聚糖的制备以苄基三乙基氯化铵(TEBA)作催化剂，催化剂使用量6%，反应温度90℃，反应时间5 h，m(壳聚糖)：m(氯乙酸)为1∶5时，相转移法制备的羧甲基壳聚糖质量较好，取代度和溶解率分别达到1.35和99.10%。
       3.6  羧甲基壳聚糖的红外光谱分析用KBr压片法对羧甲基壳聚糖壳聚糖进行红外光谱测片,,具体谱图见图5，由图中可以看出，1 093 cm-1处的-OH变形振动峰和3 444 cm-1处的-OH收缩振动峰的位移都没有发生变化, 但是峰强度在羧甲基化后明显减弱；1 657cm-1处的氨基N-H变形振动峰的位移也没有发生变化,强度变弱，但变化没有-OH振动峰明显；这说明了羧甲基化反应羧甲基化反应既发生在-OH上,也发生在-NH2，但主要发生在C6位的-OH。这主要是因为C6位上羟基空间位阻较小，其活性比C2位的氨基活泼，氧的电负性又比氮大，因此，C6位的羟基亲核性要比氨基强，C6位氧取代速度应比C2位的氨取代速度快； Hayes［8］利用核磁证实羧甲基取代同时在羟基和氨基上进行，部分实验取代度大于1也表明了这一点。
       3.7  羧甲基壳聚糖的X射线衍射的测定壳聚糖及羧甲基壳聚糖的X-射线衍射光谱见图6。图中可以看出壳聚糖除了在20°附近有一衍射峰外，26.5°处也有一明显的衍射峰。但经羧甲基化改性后，两处峰明显减弱甚至消失，说明晶体结构基本被破坏,几乎成为无定型态。羧甲基壳聚糖能够溶解于水,除了因为引入-CH2COONa亲水基团外,还因为其破坏了壳聚糖的晶体结构。
       4  结论
       本实验以TEBA为相转移催化剂，采用连续加碱法，用氯乙酸对壳聚糖进行化学改性,合成几乎完全水溶的羧甲基壳聚糖。
       通过对催化剂用量、反应温度、反应时间、投料比等影响因素的考察发现：以苄基三乙基氯化铵(TEBA)作催化剂，催化剂使用量6%，反应温度90℃，反应时间5h，m(壳聚糖)：m(氯乙酸)为1∶5时，相转移法制备的羧甲基壳聚糖质量较好，取代度和溶解率分别达到1.35%和99.10%。
       采用连续加碱法制备羧甲基壳聚糖，使得壳聚糖的水溶性得到了很大的改善，分次加入氯乙酸,可以有效地控制好反应温度,大大提高了氯乙酸利用率，优化了工艺路线,从而扩大了其应用范围,具有很好的工业前景。
       【参考文献】
         　　［1］朱兴年.壳聚糖在中药提取液中的应用研究［J］.时珍国医国药，2002，13（9）：557.
       
       ［2］王鲁妹，张 芹，唐 辉，等. 天山花楸叶醇提液的絮凝工艺［J］ .时珍国医国药，2009，20(6):1376.
       
       ［3］Kima M S ，Sung M J ，Seoc S B ，et al. Water- soluble chitosan inhibits the production of proinflammatory cytokine in human astrocytoma cells activated by amyloid β peptide and interleukin -1β［J］. Neuroscience Letters， 2002, 321 (1): 105.
       
       ［4］夏树伟，隋卫平，陈国华.羧甲基壳聚糖衍生物及其振动光谱的理论研究［J］.物理化学学报，2002, 18(2)：248.
       
       ［5］Toshinori S , Tsuyoshi I, Yoshio O. In vitro gene delivery mediated by chitosan. Elect of pH, serum, and molecular mass of chitosan on the transfection efficiency［J］ . Biomaterials, 2001,22 (6) : 2075.
       
       ［6］肖玉良，李玉琴，夏成才，等. 相转移催化法制备羧甲基壳聚糖及其性能表征［J］.食品科学，2009， 30(6):39.
       
       ［7］Zeng J，Zheng LY. Studies on Penicillium sp. ZDZ1 chitosanase immobilized on chitin by cross-linking reaction［J］. Process Biochemistry, 2002,38(4): 531.
       
       ［8］Hayes E.R. N.O-Carboxymethyl chitosan and preparative method therefore ［P］. US: 619995，1986.