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       【摘要】 
       目的优选出延胡索最佳产地醋煮工艺。方法首先对温度、用醋量和拌润时间进行了单因素考察，然后采用正交实验，以用醋量、拌润时间和粒度作为正交设计因素，再采用HPLC法测定延胡索中延胡索乙素、原阿片碱和去氢紫堇碱3种有效成分的含量，最后获得延胡索最佳产地醋煮工艺。结果延胡索最佳产地醋煮工艺即选小个子药材加40%的醋和适量水拌润4 h后煮至醋液吸尽；大个药材应适当破碎后再炮制。结论优选出的延胡索最佳产地醋煮工艺简单易操作，稳定可行。
       【关键词】  产地加工； 醋煮工艺； 延胡索； 延胡
       Studies on the Origin- boiling with Vinegar Technology of Rhizoma Coridalis
       TIAN Yongliang, DOU Zhiying*, CAO Liu, WANG Ping, LI Yingchun
       Tianjin TCM University, Tianjin 300193, China
       Abstract：Objective To optimize the origin-boiling with vinegar technology. MethodsSingle-factor experiment was carried out with temperature, vinegar volume and mixing time at first, orthogonal experiment was carried out with vinegar volume, mixing time and particle size as factors of the orthogonal experiment design. HPLC was used to determine the contents of tetrahydropalmatine, protopine and dehydrocorydaline which were the three main active ingredients in Rhizoma Corydalis. At last, the optimum origin- boiling with vinegar technology of Rhizoma Coridalis was obtained. ResultsThe optimum origin- boiling with vinegar technology of Rhizoma Coridalis was that the small Corydalis was added 40% vinegar and infiltrated 4h and boiled, the big ones was processed after breaking.ConclusionThe optimum origin- boiling with vinegar technology of Rhizoma Coridalis is simple, easy and stably.
       Key words：Origin-processing;   Boiling with vinegar technology;   Corydalis tuber;   Tetrahydropalmatine;  Protopine;   Dehydrocorydaline
       
       延胡索为罂粟科(Papaveraceae)植物延胡索Corydalis yanhusuo W.T.Wang的干燥块茎。具有活血、利气、止痛之功效，临床用于治疗胸胁、脘腹疼痛、经闭痛经、产后瘀阻、跌扑肿痛等症［1］。延胡索中主要有效成分为生物碱，在药材中多数以结合态的生物碱盐存在，少数碱性极弱的以游离态形式存在［2］。由于市售的延胡索都是经过产地水煮加工并经炮制后作为临床药用的，这样工序较繁琐，质量难以控制和保证。在产地加工过程中，延胡索水煮后损失了很多有效成分，有学者调研时发现（毛淑杰，游修琪，顾雪竹.产地不同采制方法对延胡索质量的影响.中华中医药学会炮制分会2008年学术研讨会论文集，2008：210.），当地农民有用其水煮液治病的，而且疗效很好。根据本实验室对不同炮制方法对延胡索中有效成分含量影响［3］的考察结果，延胡索鲜品经醋煮后的水提液中，其主要有效成分延胡索乙素、原阿片碱和去氢紫堇碱的含量也较高。因而本实验选择了鲜品醋煮作为产地加工炮制一体化的工艺，以延胡索乙素、原阿片碱和去氢紫堇碱作为指标，先进行了对烘制温度、用醋量和拌润时间的单因素考察，再通过采用正交实验法，以用醋量、拌润时间和粒度为考察因素，优选出延胡索产地醋煮工艺的最佳条件，以期为产地加工与炮制一体化工艺的进一步研究奠定基础。
       1   仪器与试药
       DHG78-1烘箱（湖北省黄石市医疗器械厂）  ；BP121S电子天平（瑞士托利斯） ；X205红外感应天平（十万分之一，METTLER TOLEDO）；AS20500AT超声波清洗器（天津奥特赛恩斯仪器有限公司）；日本岛津HPLC系统（SCL-10AVP HPLC Pump；SPD-M10AVP二级管阵列检测器）；自动进样系统；色谱柱TC–C18（250 mm×4.6 mm, 5 μm，Agilent）。
       
       延胡索乙素对照品 （批号：0726-200409  中国药品生物制品检定所）；去氢紫堇碱对照品（ 批号：043-27611  日本和光纯药工业株式会社）；原阿片碱对照品 （批号：0853-200201  中国药品生物制品检定所）。
       食用醋（天津市天立独流老醋股份有限公司）；水（蒸馏水及色谱用水）；  甲醇，乙腈（色谱纯，天津协和昊鹏色谱科技有限公司）； 三乙胺，磷酸（分析纯，天津市北方天医化学试剂厂）。
       延胡索鲜药材产地为陕西董家营，经本校中药鉴定教研室马琳教授鉴定为罂粟科植物延胡索Corydalisyanhusuo W.T.Wang.的干燥块茎。本实验中，延胡索药材炮制时的含水量为38%。
       2  方法与结果
       2. 1  含量测定方法的建立［3］
       2.1.1  色谱条件色谱柱为Agilent TC–C18（250 mm×4.6 mm, 5 μm），美国安杰伦公司；流动相为乙腈-0.1%磷酸溶液(三乙胺调pH 5.3)（28∶72），流速为1 ml/min，柱温为35℃，检测波长为280 nm，在此条件下，理论塔板数按延胡索乙素峰、原阿片碱峰和去氢紫堇碱峰计算均不低于3 000。空白溶剂色谱图中在与延胡索乙素、去氢紫堇碱、原阿片碱色谱峰相应位置上无峰，说明此系统条件无干扰。色谱图见图1。
       2.1.2  对照品溶液的制备 
       精密称取去氢紫堇碱对照品1.38 mg，延胡索乙素对照品2.15 mg，原阿片碱对照品1.776 mg，分别置10 ml容量瓶中，加甲醇至刻度。再分别吸取去氢紫堇碱、延胡索乙素、原阿片碱对照品溶液2.5，0.6，0.8 ml于10 ml容量瓶中，加甲醇至刻度，配制去氢紫堇碱为0.034 5 mg/mL、延胡索乙素为0.012 9 mg/ml、原阿片碱为0.014 208 mg/ml的混合对照品储备液。
       2.1.3   供试品溶液的制备 
       精密称取样品粉末0.5 g，精密加水25 ml，超声提取2次，30 min/次，滤过，合并滤液，定容到100 ml容量瓶中，过0.45 μm微孔滤膜，取续滤液，即得。  
       2.1.4   线性关系的考察
       精密吸取混合对照品储备液，以甲醇配置浓度分别为：去氢紫堇碱0.034 5，0.001 725，0.008 625，0.005 175，0.004 312 5，0.002 587 5 mg/ml，延胡索乙素0.012 9，0.006 45，0.003 225，0.001 935，0.001 612 5，0.000 967 5 mg/ml，原阿片碱0.014 208，0.007 104，0.003 552，0.002 131 2，0.001 776，0.001 065 6 mg/ml。吸取10 μl注入高效液相色谱仪，测定峰面积。以峰面积(X)为横坐标，浓度(Y)为纵坐标，绘制标准曲线，测定去氢紫堇碱的回归方程为Y=3×10-8X+0.000 5，r＝0.999 9，线性范围为：0.025 875～0.345 μg。延胡索乙素的回归方程Y=1×10-7x+0.000 2，r＝0.999 9，线性范围为：0.009 675～0.129 μg。原阿片碱的回归方程为Y=1×10-7x+0.000 3，r＝0.999 6，线性范围为：0.010 656～0.142 08 μg。
       2.1.5   方法学考察
       精密度：精密吸取供试品溶液，重复进样6次，测得去氢紫堇碱峰面积RSD＝0.04％，延胡索乙素峰面积RSD＝0.23％，原阿片碱峰面积RSD＝0.65％，表明精密度良好。
       稳定性：取同一供试品溶液，分别于0，2，4，6，8，10h进样测定，测得去氢紫堇碱峰面积RSD＝1.10%，延胡索乙素峰面积RSD＝0.40％，原阿片碱峰面积RSD＝1.10％，表明供试品溶液在10 h内稳定。
       重复性：取同一批号样品，按照供试品溶液的制备方法，分别制备6份供试品溶液，测定去氢紫堇碱、 延胡索乙素、原阿片碱的平均含量分别为1.298，0.484 3，0.498 mg/g，RSD分别为2.70％，2.10％，2.70％。结果表明本方法重复性良好。
       加样回收率实验：精密称取6份已测知含量的样品各0.25 g，添加各对照品溶液适量, 按样品含量测定项下方法操作，测得去氢紫堇碱、延胡索乙素、原阿片碱平均加样回收率分别为99.50%，99.75％，97.78%，RSD分别为2.90％，2.70％，1.70%。结果见表1。表1  延胡索水提液的加样回收率试验结果（略）
       2.2  单因素考察
       2.2.1   烘制温度考察 称取延胡索药材9份，用40%的醋浸润12 h，分别在50，60，80，100，120，140，160，180℃和200℃烘干，粉碎过40目筛，备用。
       2.2.2   用醋量的考察称取延胡索药材7份，分别加入10%，20%，30%，40%，50%，60%和70%的醋，并加适量水浸润12 h。煮至醋液吸尽，烘干，粉碎过40目筛备用。
       2.2.3   拌润时间的考察
       称取延胡索药材8份，加入40%的醋和适量的水，分别拌润2，4，6，8，10，12，18，24 h，煮至醋液吸尽，烘干，粉碎过40目筛备用。
       2.2.4  样品的含量测定
       取各炮制样品，按项“2.1.3”下的方法制备供试品溶液，精密吸取各供试品溶液20 μl，分别注入高效液相色谱仪，测定含量。以去氢紫堇碱X（权重40%），延胡索乙素Y（权重40%）和原阿片碱Z（权重20%）的含量（mg/g）为指标进行评分，评分=100×（X×40%/Xmax+Y×40%/Ymax+Z×20%/Zmax）。结果见表2～4。表2  不同温度的延胡索样品中3种成分的含量（略）表3  不同用醋量的延胡索样品中3种成分的含量（略）表4  不同拌润时间的延胡索样品中3种成分的含量（略）
       结果表明，温度对3种有效成分的含量影响不大；用醋量：10%～30%的用醋量下测得的3种有效成分含量相差甚微，40%～70%的用醋量下测得的有效成分含量也很接近，而且明显高于前3个水平的用醋量；拌润时间以拌润8 h时3种有效成分的含量是最高的。根据各单因素的优选结果综合后选定延胡索炮制工艺中各技术参数为：温度100～180℃，用醋量为40%，拌润时间为8 h。
       2.3   正交实验优选延胡索的最佳醋煮工艺
       2.3.1   正交试验设计
       在参考文献和单因素考察的基础上，正交设计选择了以粒度、用醋量、拌润时间为考察因素，每个因素3个水平。见表5。表5  炮制因素水平（略）
       2.3.2  样品的炮制
       取延胡索药材大、中、小3份，将每份平均分成3份，按L9（34）正交实验安排如表6。表6  延胡索药材炮制实验设计表及结果（略）
       2.3.3   样品的含量测定
       取各样品，按“2.1.3”项下的方法制备供试品溶液，精密吸取各供试品溶液20 μl，分别注入高效液相色谱仪，测定含量。以去氢紫堇碱X（权重40%），延胡索乙素Y（权重40%）和原阿片碱Z（权重20%）的含量（mg/g）为指标进行评分。结果见表6。方差分析结果见表7。评分=100×（X×40%/Xmax+Y×40%/Ymax+Z×20%/Zmax）。表7  延胡索药材正交实验方差分析结果（略）
       表6直观分析结果表明，延胡索醋煮鲜延胡索最佳工艺为A3B2C1，即小个延胡索加40%的醋和适量水拌润4 h。大个药材应当适当破碎后炮制。方差分析结果表明影响因素依次为粒度＞用醋量＞拌润时间，且3个因素均有显著性影响。
       2.3.4   验证试验
       将鲜延胡索分别按照指定的最佳炮制工艺平行炮制3份，应用建立的含量测定方法进行含量测定。结果见表8。表8  延胡索醋煮最佳工艺验证实验（略）
       结果表明，验证实验样品综合评价与优选结果相近，说明优选的工艺条件比较稳定可行。
       3  讨论
       由于醋煮工艺简单易行，不需要其他特殊的设备，只要在原来产地加工——水煮延胡索过程中加入食醋适量，并煮至醋液吸尽即可，此工艺既简单易行，又可以避免有效成分的损失，因此较适合于作为产地加工与炮制一体化的工艺。
       一般在辅料炮制过程中用文火，温度在100℃左右，且往往高于100℃［4］。有报道称［5］元胡拌醋后加热处理对其中的有效成分是有影响的。而本实验考察了温度对延胡索中有效成分的影响，结果发现温度对3种有效成分影响不大，对延胡索乙素和原阿片碱几乎没有影响，因此未将温度作为正交实验的因素，醋煮延胡索时加热至沸腾后保持微沸即可。有研究表明（游修琪，李先端，顾雪竹.醋制增效理论实验研究1—大剂量醋重复炮制对延胡索成分的影响中华中医药学会炮制分会2008年学术研讨会论文集，2008），延胡索的最大吸醋量为药材的70%，因此本实验考察了10%到70%的用醋量对延胡索有效成分的影响。通过文献及预实验：适量破碎的延胡索10g加水后完全浸透时间为2 h，吸水11 ml，即延胡索的吸水量约为1.09 ml/g，所以本实验中加辅料时均用水作适量稀释。搅拌浸润过程是重要的阶段，有效成分的溶出主要在此过程发生，因此保证充分的拌润时间是必要的。由于延胡索的净制过程中要大小分档，因此我们将延胡索个子大小作为一个因素。正交实验结果发现，个子大小对炮制结果有显著性影响，而且影响是最大的，因此在延胡索醋煮工艺研究中，先将延胡索大小分档后再分别进行炮制。
       
       由于受药材收获的季节及存放条件的限制，本实验的延胡索产地加工与炮制一体化工艺研究只是进行了实验室阶段的考察和探索性的研究，实验获得的数据有限，还有待于进一步的研究和产地中试加工验证。
       【参考文献】
         　　［1］国家药典委员会.中国药典［S］.北京：化学工业出版社，2005：94.
       
       ［2］肖培根.中药化学［M］.上海：上海科学技术出版社，1997：59.
       
       ［3］曹 柳,窦志英,王 萍，等.不同炮制方法对延胡索中有效成分含量的影响［J］.中国中医药信息杂志，2009，16（6）:42.
       
       ［4］陆勇军.论影响中药炮制质量的几个主要因素［J］.时珍国医国药，2001，12(12)：1092.
       
       ［5］张成元，郭长强. 醋元胡加热与否的实验分析［J］.中药材，1990，13（6）：25.