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       【摘要】 
       目的研究蝇蛆甲壳素的制备技术，优选出适宜制备工艺。方法蝇蛆甲壳素的制备采用酸碱法，产物含氮量测定采用凯氏定氮法，灰分含量测定采用550℃灼烧法。结果脱蛋白最佳工艺为以4%NaOH室温浸泡两天，并更换NaOH 1次；脱色工艺使用1% KMnO4；最佳脱钙工艺为2 mol·L-1盐酸在25℃下反应6 h。结论使用酸碱法制备的蝇蛆甲壳素质量指标可达食品级甲壳素标准。
       【关键词】  昆虫资源； 蝇蛆； 甲壳素； 制备
        甲壳素是自然界中唯一带正电荷的一种天然高分子聚合物，是保护生物的一种结构物质，结晶构造坚固，一般不熔化，也不溶于一般的有机溶剂和酸碱，只溶于浓酸和某些溶剂。化学性质非常稳定，应用有限［1］。自然界中的甲壳素大多总是和不溶于水的无机盐及蛋白质紧密结合在一起。人们为了获取甲壳素，往往将甲壳动物的外壳通过化学法或微生物法来制备。家蝇属于再生资源，在昆虫世界里，苍蝇的繁殖能力位居第一，干蛆中甲壳素的含量高于虾蟹中甲壳素的含量，因此更具有可利用价值［2］。本文采用贵州琨恩生物技术公司利用酿造茅台酒的酒糟饲养的蝇蛆制备蝇蛆甲壳素，并进一步脱乙酰制成壳聚糖（将另文报道），有利于扩大壳聚糖的来源，充分发挥资源优势。
       1  材料与仪器
       1.1  材料蝇蛆，贵州琨恩生物技术公司；氢氧化钠（化学纯，分析纯）；浓盐酸（化学纯）；高锰酸钾（化学纯）；草酸（化学纯）；浓硫酸（分析纯）；硫酸钾（分析纯）；硫酸铜（分析纯）。
       1.2  仪器HH－2数显恒温水浴锅，国华电器有限公司；RAT玻璃反应釜，上海生物科技有限公司；凯氏定氮仪，上海第二玻璃仪器厂；KDM型可调恒温电热套，山东华鲁电热仪器有限公司；马弗炉，上海路达实验仪器有限公司；202－2电热恒温鼓风干燥箱，上海路达实验仪器有限公司。
       2  方法
       2.1  样品制备取清洗干净的新鲜蝇蛆，置中药粉碎机中破碎。浆料置筛中清洗并过滤，所得蛆皮沸水浴浸泡后过滤清洗。蛆皮低温干燥备用。
       2.2  提取工艺样品→氢氧化钠脱蛋白→高锰酸钾、草酸脱色→盐酸脱钙→蝇蛆甲壳素产品脱蛋白工艺及脱钙工艺参数的确定采用正交实验法，脱色工艺采用单因素实验法。
       2.3  制备工艺研究
       2.3.1  脱蛋白工艺的正交实验研究精密称取数份干燥蛆皮，分别加入不同浓度NaOH，在不同温度水浴中保温反应，搅拌。反应结束后，过滤，干燥。用凯氏定氮法测定含氮量。实验结果为3次实验的平均值。
       采取正交实验法对蝇蛆皮脱蛋白工艺进行优选。选择NaOH浓度、反应温度和时间作为考察因素，以产物含氮量为评价指标，用L9（34）正交表安排正交实验，所选因素水平及正交实验方案见表1。表1  蝇蛆皮脱蛋白正交实验因素水平（略）
       2.3.2  室温、两次NaOH处理对脱蛋白程度的影响精密称取数份干燥蛆皮，分别加入2％，4％，6％，8％NaOH，室温浸泡24 h后，搅拌，同法用新鲜NaOH再处理1次。
       2.3.3  脱色工艺的研究
       高锰酸钾的浓度对脱色效果的影响:取数份除去蛋白质的样品，分别用0.5％，1％KMnO4避光浸泡数小时，清水洗涤至中性，用1 %草酸浸泡数小时，过滤，水洗至中性，低温干燥。
       草酸浸泡次数对脱色效果的影响：取数份除去蛋白质的样品，用1％KMnO4避光浸泡数小时，清水洗涤至中性，过滤，分别用1 %草酸浸泡1次、两次，每次3 h。过滤，水洗至中性，低温干燥。
       2.3.4  脱钙工艺的正交实验研究精密称取数份经脱蛋白和脱色的样品，分别加入盐酸，不同温度浸泡并搅拌。反应结束后，蒸馏水洗涤至中性，置105℃烘箱干燥恒重后测定灰分含量。实验结果为3次实验的平均值。
       采取正交实验法对蝇蛆皮脱钙工艺进行优选。选择盐酸浓度、反应温度和时间作为考察因素，以产物灰分含量为评价指标，用L9（34）正交表安排正交实验，所选因素水平及正交实验方案见表2。表2  蝇蛆皮脱钙正交实验因素水平（略）
       2.4  产物的纯化蝇蛆皮经脱蛋白、脱色及脱钙处理后，60℃干燥，将所得甲壳素混悬于蒸馏水置大烧杯中，加热，保持微沸状态，分层去处杂质。
       2.5  产品指标测定含氮量测定采用凯氏定氮法，灰分含量测定采用550℃灼烧法。
       2.6  产品的红外鉴定将产品蝇蛆甲壳素干燥至恒重，与KBr混合研磨、压片，在400～4 000 cm-1 测红外光谱图。
       3  结果
       3.1  甲壳素的制备工艺研究
       3.1.1  脱蛋白工艺的正交实验研究按照L9（34）正交实验设计表分别进行9次实验。实验结果见表3，极差分析结果见表4。表3  蝇蛆皮脱蛋白正交实验结果（略）表4  蝇蛆皮脱蛋白正交实验极差结果分析（略）
        因素A为反应时间，因素B为NaOH浓度，因素C为反应温度由正交实验结果和极差分析结果可知，RB>RC>RA，即在反应时间、反应温度、NaOH浓度这3个影响因素中，NaOH浓度对样品的含氮量影响最大，即对脱蛋白效果影响最大。其次是温度，最后是反应时间。其最优方案为此A3B3C3，此3个因素对甲壳素脱蛋白均有较大影响。
       3.1.2  NaOH浓度对室温、两次NaOH处理对脱蛋白程度的影响结果见表5。表5  NaOH浓度对脱蛋白程度的影响（略）
       从节约能源的角度出发，考察室温条件下碱处理脱蛋白的可行性。反应结果表明，室温下，NaOH浓度越大，产物含氮量越低，蛋白质的脱除越彻底。以4％NaOH浸泡两天，并更换碱液1次，也可达到制备要求。
       3.2  脱色工艺的研究不同脱色工艺处理后的样品取相等的量,用相同大小的培养皿盛放,编号。脱色效果的观察采用3人双盲法按样品颜色从浅至深排序。结果1％KMnO4脱色效果优于0.5％KMnO4。两次草酸浸泡脱色效果显著优于一次草酸浸泡，原因是高锰酸钾为强氧化性脱色剂，反应后样品变为紫黑色，草酸的作用是除去多余的高锰酸钾，两次处理能较完全除掉多余的高锰酸钾，使样品十分洁白。
       比较理想的脱色工艺是用1％KMnO4避光浸泡数小时，清水洗涤数次至中性，过滤，再用1%草酸浸泡数小时，换用1次草酸，脱色效果良好。
       3.3  蝇蛆皮脱钙正交实验按照L9（34）正交实验设计表分别进行9次实验，实验结果见表6、极差分析结果见表7。表6  蝇蛆皮脱钙正交实验结果（略）表7  蝇蛆皮脱钙正交实验极差结果分析（略）
       由正交实验结果和极差分析结果可知，RC>RA>RB，即在反应时间、反应温度、碱浓度这3个影响因素中，反应时间对样品的灰分含量影响最大，即对脱钙效果影响最大，其次是酸浓度，最后是反应温度。从极差来看，此3因素对样品的灰分含量影响都不大。其最优方案为此A3B3C3，鉴于反应温度对脱钙效果影响很小，所以从经济的角度考虑，最优方案为A3B1C3。
       3.4  产物的纯化蝇蛆皮经脱蛋白、脱色及脱钙处理后，60℃干燥，得到无黑点的浅黄白色产品。为了进一步纯化产物，我们将所得甲壳素混悬于蒸馏水置大烧杯中，加热，保持微沸状态，可见混悬其中的甲壳素分为3层：上层黄色，中层乳白色，下层纯白色。将各层分离，干燥，中、下层即为成品甲壳素；上层量较少，为黄色油脂状物，经实验发现此物不溶于酸、碱，亦不溶于乙醚、石油醚等有机溶剂。
       3.5  产物的鉴别蝇蛆皮脱蛋白脱钙的产物是甲壳素，其红外光谱见图1，由图分析可知：3 433.40 cm－1是N-H伸缩振动的吸收峰与O-H伸缩振动的吸收峰，由于甲壳素分子中存在大量氢键，导致该频率下的谱带强而宽。2 858.57～2 924.99 cm－1是C－H伸缩振动的吸收峰。1 629.80 cm－1， 1 576.71 cm－1是酰胺I谱带，前者可能是C=O与C-H的氢键造成的，而后者是C=0与N-H的氢键造成的，说明分子中有乙酰胺基存在。N-H的面内弯曲与C－N伸缩振动是混合在一起的，其中之一是1 425.07 cm－1（酰胺II谱带），另一个则是1 378.48 cm－1(酰胺III谱带)。在甲壳素的光谱中表现1 321.48 cm－1的摇摆振动也包含在这个吸收峰中。从上述结果分析中可知，此样品为甲壳素。
       4  讨论
       4.1  脱蛋白工艺在脱蛋白反应过程中，反应时间、反应温度、NaOH浓度这3个影响因素，NaOH浓度对样品的含氮量影响最大，其次是温度，最后是反应时间。其最优方案为8％NaOH,在80℃下反应3 h,可制得脱蛋白较完全的甲壳素。
       NaOH浓度是脱蛋白工艺的主要影响因素，温度也是脱蛋白工艺的主要影响因素。稀碱脱蛋白的反应原理为蛋白质被碱催化水解，在水解过程中，逐渐降解成分子量越来越小的肽段，直到最后变成氨基酸的混合物。从实验结果可见，随着NaOH浓度的提高，反应温度的升高，反应时间的延长，产物的含氮量降低，但含氮量降质至4％～5％时，不再下降。由于蝇蛆皮中蛋白含量低，高浓度碱液不利于降低成本和环境保护，而且过于剧烈的反应条件，可能会破坏甲壳素的分子结构和功能特性，使产物色泽加深，影响产物质量。综合考虑各方面因素，蝇蛆皮脱蛋白的最佳工艺为以4％NaOH室温浸泡两天，并更换NaOH一次。
       4.2  脱色工艺甲壳素的脱色，主要是将甲壳素的颜色去除，使甲壳素颜色变浅，另一方面，也包括了将甲壳素中残留的蛆头、口器等黑点去掉，提高甲壳素的白度，以便于加工生产成浅色产品，改善甲壳素的外观性状，提高产品档次，从而提高原料的利用价值。
       比较理想的脱色工艺是用1％KMnO4避光浸泡数小时，清水洗涤数次至中性，过滤，再用1%草酸浸泡数小时，换用一次草酸，脱色效果良好。
       在脱色之前，甲壳素不宜粉碎成较小颗粒，以免被氧化降解，形成更小颗粒或细粉末状，影响产物回收率，降低得率。更重要的是，脱色过程中要保护甲壳素本身所具有的各项性能指标，高锰酸钾作用时间也要严格控制，以免作用时间过长加重甲壳素分子的降解程度，使最终产物壳聚糖分子量减小，黏度降低，从而影响其作用效果。同时，还要保护壳聚糖不被反应过程中产生的其它离子所污染，从而达到彻底脱色的目的。
       4.3  脱钙工艺在脱钙反应过程中，反应时间、反应温度、碱浓度这3个影响因素，反应时间对样品的灰分含量影响最大，其次是酸浓度，最后是反应温度。其最优方案为2 mol/L盐酸，在25℃下反应6 h，可制得脱钙较完全的甲壳素。
       用稀盐酸浸泡脱钙的原理在于用盐酸处理后，蛆皮中的碳酸钙等无机盐转化成它们的盐酸盐溶解于水中，同时产生碳酸，碳酸不稳定，立即分解为二氧化碳和水，通过洗涤、分离，即可除去无机盐。相对于虾蟹壳来说，蝇蛆皮钙含量本来就较低，因此，只要有足够量的酸溶液，反应时间足够长，碳酸钙的分解反应即可顺利进行，且进行程度较完全。从实验结果可看出，反应的最低条件即1 mol/L HCl,25℃，2 h即可得到灰分含量为0.2％左右的甲壳素，所以再提高反应条件，灰分含量的改变也不会太大。但是，从脱钙各因素水平趋势图可看出，在A2B2C2条件下，产物灰分含量反而较高，可能是由于蛆皮中碳酸钙、蛋白质及甲壳素的紧密结构，脱蛋白后少量残余蛋白质溶出，使碳酸钙的反应受到阻碍，则相应碳酸钙的反应也基本趋于停滞状态。
       【参考文献】
         　　［1］柴平海，张文涛，金鑫荣.甲壳素/壳聚糖开发和研究的新动向［J］.化学通报，1999，7:26.
       
       ［2］徐宁彤，曲琪环，周玉岩，等.从蝇蛆中提取壳聚糖的研究［J］.饲料博览，2006，7：32.