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       【关键词】  黄芪注射液；,,基因报告系统；,,雌激素受体；,,HeLa细胞；,,配体结合域
       摘要：目的构建含有雌激素受体配体结合域的哺乳动物细胞杂交基因报告系统，研究黄芪注射液对雌激素受体（ER）活性的影响。方法 PCR扩增雌激素受体配体结合域，将配体结合域克隆到真核表达质粒 pCMV-BD构建细胞杂交基因报告系统,研究黄芪注射液与雌激素受体的关系；MTT法检测黄芪注射液对细胞活力的影响。结果成功构建含有雌激素受体配体结合域的哺乳动物细胞杂交基因报告系统，黄芪注射液不能提高细胞活性，但对雌激素受体具有激活作用。结论黄芪注射液可能通过雌激素受体发挥疗效，细胞杂交基因报告系统是研究中药作用机理的手段之一。
       关键词：黄芪注射液；  基因报告系统；  雌激素受体；  HeLa细胞；  配体结合域
       Activating Effect of Astragalus Injection on Estrogen Receptor
       WANG Haibin， WANG Junjian*， HUANG Hui，  LIU Lin ， LIU Shaojun， XU Chuanyi，HE Wei, FAN Yueguang, HUANG Zhiwei
 
　　(Department of Orthopedic Surgery, First Affiliated Hospital of  Guangzhou University of TCM ＆ Pharmacology，Guangzhou 510405, China；Guangzhou Institute of Biomedicine and Health, Chinese Academy of Sciences，Guangzhou 510663, China)
       Abstract:ObjectiveTo establish the Gal4DBD-ER or ERLBD report system to study the effect of Astragalus Injection on ERs.MethodsGene report system was generated by amplifying the ligand binding domain(LBD ) with Pfu polymerase and subcloning the product into the eukaryotic expression vector pCMVBD. This system was employed to study the relationship between Astragalus Injection and ERs. Cell activity were detected by MTT.ResultsGene reporter system using ER-LBD is established. Astragalus Injection can not improve cell activity but can activate ERs activation.ConclusionThe mechanisms of Astragalus Injection may be related to its effect of activating ERs. Gene report system can be used to study the mechanisms of Chinese traditional medicine.
       Key words:Astragalus Injection；  Gene Report system；  Estrogen receptor；  HeLa cell；  Ligand binding domain
   
　　雌激素受体（Estrogen receptor, ER）是一个核转录因子, 属甾体激素受体家族成员，调控基因表达。ER在1967 年被首次发现［1］， 20 多年来, 它作为内分泌治疗的预测因子被广泛应用。1996 年 ERα首次从大鼠中克隆［2］，其后人和小鼠也相继发现 ERβ的表达［3，4］。ERα和 ERβ的结构、功能存在差异, 在乳腺癌的发生发展中发挥不同作用［5］ 。因而研究药物对雌激素受体的作用，将有利于我们认识药物的作用机理。黄芪主要有补气的作用,在临床上主要治疗以气虚为主证的疾病，在处方中多以君药出现,具有补中益气、补气升阳、益卫固表的作用。为了进一步探讨其作用机理，本研究采用哺乳动物细胞杂交技术研究黄芪注射液对雌激素受体配体结合域的作用，探讨黄芪对雌激素受体的部分作用。
       　　1  材料与方法
       1.1  材料Hela 细胞由中国科学院广州生物医药与健康研究院裴端卿研究员赠送；DMEM无血清、无酚红培养基、胎牛血清、青霉素和链霉素购自 Hyclone公司；Lipofactemine2000购自 Invitrogen公司；SteadyGlo荧光检测试剂盒购自 Promega公司；细胞培养板均购自 Corning Costar公司；MTT购自 Molecular公司； 黄芪注射液(上海禾丰药业)。
       1.2  PCR 扩增 hERa-LBDcDNA 　　根据 gene bank报道的 ERs序列（M12674和NM001437），设计 hERa-LBD和 hERb-LBD cDNA 序列的引物,在5’端引入一个 BamH Ⅰ的酶切位点,在 hERa-LBD的3’端引入一个 Eco R Ⅰ的酶切位点， 在 hERb-LBD的3’端引入一个 Hind Ⅲ的酶切位点，引物序列如下。上游5’GCGGATCCGGAGGGAGAATGTTGAAAC3’下游　5’GCGAATTCTCAGACTGTGGCAGGGAAAC3’；Human ERβLBD引物序列：上游5’GCGGATCCGGCAAGGCCAAGAGAAGTG3’下游5’　GCAAGCTTTCACTGAGACTGTGGGTTC3’。以 cmxp-ERa和 cmxp-ERb 全长 cDNA 质粒为模板进行 PCR 反应。反应程序为：94 ℃,5 min ；94 ℃，1 min ；55 ℃，1 min ；72 ℃，2 min ； 72 ℃，7 min循环20次；PCR 产物进行1 % 琼脂糖凝胶电泳,用琼脂糖凝胶纯化试剂盒纯化并回收所需 DNA 片段,纯化的 DNA 溶解在50 μl 的 TE 缓冲液中。
       1.3   哺乳动物细胞表达质粒 pCMV-hER LBD的构建　　用 BamH Ⅰ和 EcoRI双酶切 PCR 产物,琼脂糖凝胶纯化试剂盒回收纯化 DNA ，加入经相同双酶切处理、凝胶纯化回收的 pCMV-BD载体，经过连接反应，构建成 pCMV-Gal4 hERaLBD 和 pCMV-Gal4 hERβLBD质粒。反应体系为：pCMV-BD 2μl (50 ng ) , hERaLBD或 hERβLBD 6 μl (100 ng) ，10 ×连接缓冲液1 μl ，T4 DNA 连接酶1 μl (3 U) ；16℃过夜连接； 将1 μl 连接产物转化大肠杆菌 DH5a感受态细胞, 卡那霉素抗性筛选阳性克隆。小量提取质粒,双酶切消化，1 % 琼脂糖凝胶电泳，鉴定阳性重组质粒并测定序列。
       1.4   细胞培养胎牛血清采用 Charcoal-strip处理，人子宫癌细胞系 Hela培养在含10%  Charcoal-Strip胎牛血清及抗生素（青霉素100 U/ml,链霉素100 μg/ml）的无酚红 DMEM 培养基中，37℃，5% CO2 的 二氧化碳培养箱湿润培养。
       1.5    MTT检测黄芪注射液对 Hela细胞增殖能力的影响细胞以104个/孔接种至96孔板，分成4组，每组12孔，利用含有10%胎牛血清的 DMEM培养液培养24 h之后，向培养液中分别加入不同浓度(0.001%，0.01%，0.1%)的黄芪注射液，继续培养24 h。用噻唑蓝 (MTT)比色法测定细胞的增殖能力。
       1.6   瞬时转染将处于对数生长期的细胞以104/孔传代于96孔细胞培养板中，培养过夜，长到80%～90%满时用于转染。用优化培养液MEM稀释 lipoFectamine 2000 试剂（ 0.5 μl/100 μl ）和质粒 DNA。优化培养液稀释后质粒浓度分别为：pCMV-Gal4 hERaLBD和 pCMV-Gal4 hERβLBD，25 ng/孔; pFR-Luci,50 ng/孔; pFRTlaczeo plasmid, 50 ng/孔。lipoFectamine 2000稀释5 min后，将稀释后的脂质体和质粒 DNA 等体积混合，于室温放置20 min。迅速将细胞换液成含有10％Charcoal-Strip胎牛血清的无酚红 DMEM 100 μl。再加入脂质体/ DNA 混合物,将枪头深入液面下，逐滴加入，并轻轻摇晃混匀。
       1.7   转染细胞的药物处理及检测将黄芪注射液溶于 DMSO中，在细胞瞬时转染质粒6 h后，分别加入不同浓度的黄芪注射液，并以 DMSO为对照。放于5％CO2培养箱中继续培养24 h，之后根据 Promega公司 Steady-Glo kit说明书测定细胞的荧光值，并以 β-Gal作为内标进行校正，测定 β-Gal活性。
       1.8  数据处理 用 SPSS10.0统计软件包中的方差分析进行统计学处理，所有数据均用 ±s表示,所有实验独立重复3次或3次以上。
       　　2  结果
       2.1  hERa-LBD和 hERβ-LBD的 PCR扩增和序列测定扩增产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳，在1 024 bp和883 bp处有特异性扩增条带，片段大小与预期值相符。结果见图1。序列分析结果显示得到的克隆基因序列与文献报道一致。
       M：Marker DL2000  A和B：ERa LBD  C和D：ERβ LBD
       图1  PCR产物琼脂糖凝胶电泳结果（略）
       2.2  pCMV-Gal4 hERaLBD和 pCMV-Gal4 hERβLBD的酶切分析重组质粒 pCMV-Gal4 hERaLBD和 pCMV-Gal4 hERbLBD经限制酶 BamH Ⅰ和Eco RI（Hind III）双酶切后，1.5%琼脂糖凝胶电泳结果显示酶切片段与预期值相符。结果见图2。并将质粒送测序公司测序，测序结果分别与报道的 hERaLBD和 hERβLBD序列一致。
       M： DL2000 Marker  ERa：pCMV-Gal4 hERaLBD酶切结果　ERb：pCMV-Gal4 hERβLBD酶切结果
       图2  pCMV-Gal4 hERaLBD和pCMV-Gal4 hERβLBD经双酶切之后琼脂糖电泳图（略）
       2.3  黄芪注射液对细胞增殖能力的影响HeLa细胞在高浓度（0.001%~0.1%）黄芪注射液作用24 h后，黄芪注射液不能提高细胞活力，低、高剂量与对照组相比无统计学意义（P＞0.05）的差异。结果见图3。
       2.4  黄芪注射液对雌激素受体配体结合域的激活作用 通过 Gal4DBD-ERα和 ERβ LBD 细胞杂交报告系统，本研究发现，黄芪注射液可以在高剂量（0.1%）显著地提高ERα的活性，但是小于0.01%的情况下无激活ERα活性的作用，高、低剂量的黄芪注射液对ERβ均有明显的激活的作用。结果见图 4。
       图3  MTT法检测不同剂量黄芪注射液对Hela细胞增殖能力的影响（略）
       a不同剂量黄芪注射液对 ERα的激活作用 
       b不同剂量黄芪注射液对 ERβ的激活作用
       图4  黄芪注射液对 ERs活性的影响（略）
       　　3  讨论
       我国中药具有数千年的历史，而且安全性高、副作用低，因此具有很好的发展前景，但对中医药有效成分的分析与研究还是处在早期阶段，使得我国中药的发展受到很大的限制，需要建立一个国际认可的、现代化的中药机理研究体系，来进行中药作用机理的研究。核受体家族基础研究的进展促进了新的受体病的发现, 扩大了对激素抵抗机制的认识, 为药物的设计和疾病的治疗提供了新思路［6］。核受体一般有6个功能区，其中与配体发生相互作用的是E/F区，核受体的配体结合域便有此区编码。雌激素受体是核受体中的一种，同样具有核受体的特征，具有与配体结合的配体结合域。因而可以通过细胞杂交基因报告系统，研究中药有效成分与雌激素配体结合域的相互作用，确定中药作为 ERα与 ERβ选择性配体的功能，分析中药作为促效或拮抗药的机理。所以通过克隆雌激素受体配体结合域构建细胞杂交基因报告系统对研究中药与雌激素受体的关系具有重要的作用。黄芪为豆科植物蒙古黄芪的根, 主要化学成分为蕊异黄酮、3-羟基-9, 10-二甲氧基紫檀烷、黄芪皂苷Ⅰ，Ⅴ，Ⅲ 等，部分成分属植物雌激素类。中医认为黄芪注射液是具有益气养元、扶正祛邪、养心通脉、健脾利湿之功, 主要用于治疗心气虚损、血脉痰阻之病毒性心肌炎、心功能不全及脾虚湿困之肝病。近年临床上还拓展应用于肝硬化、脑血管疾病、肾脏疾病,对其抗肿瘤机制也进行了大量研究。已知机理之一是黄芪通过红细胞C3b 受体活性增加, 免疫粘附功能增强, 自然杀伤(NK) 细胞具有广谱抗肿瘤活性,从而刺激体内免疫细胞提高机体抗肿瘤作用［7，8］。在本研究中，实验证明黄芪注射液并不能显著地使 Hela细胞增殖。利用高保真Taq酶克隆到两种雌激素受体亚型的配体结合域，并将其成功克隆到含有 Gal4 DNA 结合域的真核表达质粒中，利用细胞杂交基因报告系统研究了黄芪注射液对雌激素受体的作用。发现黄芪注射液在高、低剂量下均可显著提高雌激素受体ERβ的活性，只有高剂量下才可激活雌激素受体ERα的活性。由此推测，黄芪注射液可能是通过，至少部分通过雌激素受体发挥其促进细胞活力增加，并在治疗各种疾病中发挥疗效。文献报道蕊异黄酮、黄芪皂苷是生物活性较弱的雌激素, 可以与人体ER结合形成ER2复合物, 通过核内转录通路, 即在细胞核内利用DNA反应元件的基因转录, 翻译成效应蛋白, 起到促进细胞增殖的生物学效应, 取代完整的雌激素反应［9］。黄芪因浓度不同分别起雌激素和抗雌激素的双相作用。低浓度(1×10-5～1×10-8)mol/L时表现出雌激素作用, 而高浓度(1×10-4～ 1×10-5) mol/L时则表现出抗雌激素作用。其类似雌激素作用是由ER介导的, 标志是刺激肽合成酶2 (PS2)mRNA 的表达; 而抗雌激素作用并不由 ER介导, 在 ER阴性细胞中仍然表现出抗增生作用［10］。本研究首先成功构建了含有雌激素受体配体结合域的细胞杂交基因报告系统，并成功研究了黄芪注射液与雌激素受体的关系，为将来中药作用机理的研究提供了一个新的思路和技术平台。
       　　参考文献：
       ［1］  Toft D , Shymala G, Gorski J . A receptor molecule for estrogens : studies using a cell - free system［J］.Proc Natl Acad Sci USA , 1967 , 57 :1740.
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       ［4］  Tremblay GB , Tremblay A , Copeland NG, et al. Cloning , chromosomal localization , and functional analysis of the murine estrogen receptor［J］.Mol Endocrinol , 1997 , 11 : 353.
       ［5］  Speirs V , Kerin MJ . Prognostic signifigance of estrogen receptor beta in breast cancer［J］. Br J Surg , 2000 , 87 : 405 .
       ［6］  徐仁宝.核受体家族研究的进展［J］.第二军医大学学报，2001， 22 (11)：1053.
       ［7］  任  澎,程祖亨,马依彤,等. 黄芪注射液对充血性心力衰竭患者的急性血液动力学效应［J］.中国中西医结合杂志,1998 ,18(8) :460.
       ［8］  邬伟里,戴耀华. 黄芪治疗早期糖尿病肾病疗效观察［J］.上海医药,2000,21(3):19.
       ［9］  郭瑞霞, 魏丽惠. 17β-雌二醇对子宫内膜癌细胞磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B信号传导通路的激活作用［J］.中华妇产科杂志, 2004,39(7):469.
       ［10］  Kurzer MS Hormonal effects of soy isoflavones: studies in premenopausal and postmenopausal women［J］.J Nutr. 2000;130(3):660S.
       基金项目：国家自然科学基金资助项目(No.30400606)       
       广东省自然科学基金资助项目(No.04010036)     
       广东省科技厅科研项目(No.粤科社字2004，139号)
       广州中医药大学校创新基金资助项目(No.K004044)
       (广州中医药大学第一附属医院，广东 广州  510405；中国科学院广州生物医药与健康研究院，广东 广州  510663)