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       【关键词】  灰树花；,,多糖,β-葡聚糖；,,,酶
       摘要：目的探讨灰树花子实体多糖中 β葡聚糖含量的测定方法。方法多糖粗提物依次用高温 α淀粉酶、木瓜蛋白酶和 α1，4葡萄糖水解酶水解，通过测定其中葡萄糖的含量计算β葡聚糖的含量。结果确定了测定方法中几种酶的用量。在0~300 mg・L-1范围内线性关系良好，测得灰树花子实体多糖中 β葡聚糖含量为3.26%~3.51%，3组样品的平均回收率为90.5%。结论该方法操作简便，准确度高。
       关键词：灰树花；  多糖 β-葡聚糖；   酶
       Enzymatic Measurement of βglucans in Polysaccharides of Grifola frondosa
       CHEN Guoguang， MENG Lei， KONG Yi*,YANG Wan , Wu Wutong
       （College of Life Science and Pharmaceutical Engineering, Nanjing University of Technology，Nanjing 210009, China；School of Life Science, China Pharmaceutical University, Nanjing, 210009, China）
       Abstract：ObjectiveAn enzymatic method for analysis of βglucan in polysaccharides of Grifola frondosa has been studied. MethodsAfter hydrolyzing by thermostable αamylose, papain and amyloglucosidase, the value of glucose were measured and the content of βglucan were computed .ResultsThe dosage of several enzymes were determined and the content of βglucan in the samples were in the range of 3.26%~3.51%. The average recovery was 90.5%. ConclusionThe enzymatic method is simple and with high accuracy.
       Key words：Grifola frondosa ;   Polysaccharide ;   βglucans;  Enzyme
   
　　灰树花（Grifola Frondosa）是一种药食兼用的珍贵大型真菌，其子实体中富含氨基酸、多糖以及微量元素等在内的多种营养成分［1］。日本学者通过对灰树花发酵。近20年的研究发现,灰树花中含有的活性多糖具有明显的抗 HIV(艾滋病病毒)、抗肿瘤，改善免疫系统功能及调节血糖、血脂及胆固醇水平、降血压等作用［2,3］，且未发现有毒副作用。研究表明灰树花多糖的免疫活性与其中 β-葡聚糖有密切的关系，因此 β-葡聚糖的含量成为衡量灰树花多糖活性的重要指标之一。本文对灰树花子实体多糖中的 β-葡聚糖的含量的测定方法进行了研究，以期为进一步研究其与灰树花多糖的活性之间的关系奠定基础。
       　　1  仪器与试剂
       1.1  原料  灰树花多糖粗提物，浙江方格药业有限公司。
       1.2   仪器  HH-2数显恒温水浴锅，Sorvall Super T21冷冻高速离心机，751型紫外分光光度计。
       1.3   试剂  高温α淀粉酶20 000 U・ml-1，宜兴市生物工程公司，木瓜蛋白酶19.2 U・ml-1，Wrothington公司 ，Amyloglucosidase (α1,4-葡萄糖水解酶)73.8 U・ml-1，Sigma公司。葡萄糖测定试剂盒，上海荣盛生物技术有限公司。
       　　2  方法与结果
       2.1   方法
       2.1.1   高温 α淀粉酶用量的确定准确称取1.0 g灰树花多糖粗提物6份，分别溶于40 ml pH6.0的磷酸缓冲液中，振荡使其溶解，向其中加入一定量的高温α淀粉酶，放入100℃水浴中反应30 min，冷却至室温。离心（8 000 r・min-1, 10 min），取上清液，加入4倍体积的95%乙醇。离心（8 000 r・min-1, 10 min），沉淀用蒸馏水定容至300 ml，即得样品溶液。吸取样品溶液0.1ml，各以水补至1.0 ml，用蒽酮硫酸法于620 nm测吸光度值。结果见图1。由图1可知,当高温 α淀粉酶的用量达到3 000 U・g-1 (多糖粗提物)后,再增加酶的用量，620 nm测得的吸光度值变化不大。因此,确定高温 α淀粉酶的用量为3 000 U・g-1 (多糖粗提物)。
       图1  高温α淀粉酶的用量对水解效果的影响(略)
       2.1.2    木瓜蛋白酶用量的确定准确称取1.0 g灰树花多糖粗提物6份，分别溶于40 ml pH 6.0的磷酸缓冲液中，振荡使其溶解，并调节 pH值到7.5，依次称取一定量的木瓜酶，以磷酸缓冲液溶解，与已进行过第一步酶解后的多糖溶液充分混匀后置于60℃水浴锅中加热30 min，冷却至室温。离心（8 000 r/min, 10 min），取上层清液，加入4倍体积的95%乙醇。离心（8 000 r/min, 10 min），沉淀用蒸馏水定容至400 ml，即得样品溶液。吸取样品溶液液0.1 ml，各以水补至1.0 ml，于280 nm测定其吸光度值。结果见图2。从图2可以看出，当木瓜蛋白酶的用量为49 U・g-1 (多糖粗提物)时280 nm测定其吸收值最低，再增加酶的用量，紫外吸收又随之增加，因此确定木瓜蛋白酶的用量为49 U・g-1 (多糖粗提物)。
       2.1.3  α1,4葡萄糖水解酶用量的确定  准确称取1.0 g灰树花多糖粗提物6份，分别溶于40 ml磷酸缓冲液中，振荡使其溶解。分别量取最适用量的 α淀粉酶和木瓜蛋白酶，按2. 1和2. 2项下的方法依次酶解。将酶解液的 pH调至4.3，依次称取一定量的Amyloglucosidase，以磷酸缓冲液溶解。加入酶解液充分混匀后置于60℃水浴锅中加热30 min，冷却至室温。离心（8 000 r/min, 10 min），沉淀用蒸馏水定容至300 ml，即得样品溶液。吸取样品溶液0.1 ml，各以水补至1.0 ml，用蒽酮硫酸法于620 nm测吸光度值。结果见图3。
       图2  木瓜蛋白酶的用量对水解效果的影响(略)
       图3   α1,4葡萄糖水解酶的用量对水解效果的影响(略)
 
　　由图3可知，当 Amyloglucosidase用量达到36.9 U・g-1 (多糖粗提物)后，再增加酶的用量，620 nm测得的吸光度值变化不大。可以认为这时葡聚糖中的α糖苷键基本水解完全。因此确定 Amyloglucosidase的最适用量为36.9 U・g-1(多糖粗提物)。
       2.1.4    灰树花多糖的处理  准确称取1.0 g灰树花多糖粗提物，用 pH 6.0的磷酸缓冲液40 ml溶解，振荡使其溶解，依次按最适用量加入上述3种酶进行水解。量取高温α淀粉酶液0.15 ml (3 000 U)，与所得的多糖溶液一起放入100℃水浴中反应30 min，冷却至室温。调节酶解液的 pH值至7.5。精密称取木瓜蛋白酶2.5mg(49 U)，用0.1 ml pH 6.0的磷酸缓冲液溶解, 与上述溶液充分混匀后置于60℃水浴锅中加热30 min，冷却至室温。调节酶解液的pH值至4.3。精密称取 Amyloglucosidase 0.5 mg(36.9 U)，用0.1 mlpH6.0的磷酸缓冲液溶解, 与上述溶液充分混匀后置于60℃水浴锅中加热30 min，冷却至室温。向其中加入4倍体积的95%乙醇，静置1h，离心（4 000 r・min-1,10 min）弃去上层清液。向沉淀部分加入72%硫酸15 ml，室温分解4 h。再加水140 ml，置于100℃水浴中加热2 h。用10 mol・L-1 NaOH调 pH值至7.0。将上述溶液定容至300 ml，离心（4 000 r・min-1，10 min），取上层清液作为待测样品。
       2.1.5    测定方法  用葡萄糖氧化酶－过氧化物酶 GOD-PAP法［4］测定2.1.4项下样品溶液的葡萄糖含量。取蒸馏水、样品溶液各10 μl，分别加入含葡萄糖氧化酶和过氧化物酶的工作液1 ml，混匀，置37℃水浴15 min，于505 nm测吸光度值。
       2.2  线性范围  准确量取浓度为0，50，100，150，200，250，300 mg・L-1葡萄糖标准液各10 μl，按照2.1.5项下方法操作，测定吸光度值。以吸光度值为纵坐标，葡萄糖浓度为横坐标。结果表明在0~300 mg・L-1范围内吸光度值和葡萄糖浓度呈良好的线性关系，标准曲线方程为 Y=0.003 6 X+0.005（r2=0.999 8）。
       2.3  回收率  准确称取灰树花多糖粗提物共3份，分别加入一定量 β葡聚糖，按照2.1.4和2.1.5项下方法操作，测定回收率。
       表1   灰树花多糖中 β葡聚糖含量测定结果及回收率(略)
       2.4    重复性取050302批号样品6份，按照2.1.4和2.1.5项下方法操作，测得β葡聚糖的含量结果见表2。
       表2   灰树花多糖中β葡聚糖重复性实验测定结果(略)
       2.5    样品测定取3批样品按照2.1.4和2.1.5项下方法操作，准确测得葡萄糖浓度后用下式计算 β-葡聚糖的含量。β-葡聚糖的含量%=葡萄糖浓度（mg・100 ml-1）×3×0.9/原料质量 (mg)×100式中0.9为校正系数。3批灰树花多糖样品050302，050316，050328测得的 β葡聚糖的含量分别为3.51%，3.26%，3.43%。
       　　3  讨论
       3.1    本实验对酶法测定灰树花子实体β-葡聚糖的方法进行了研究。测定过程中依次加入了3种酶对灰树花多糖粗体物进行处理，以去除影响测定的杂质。其中高温 α淀粉酶与 α1,4葡萄糖水解酶用于水解样品中的 α葡聚糖，而木瓜蛋白酶则酶解去除了样品中的杂蛋白。本实验中确定了3种酶的用量。对于3种酶的水解效率还有待进一步的研究。
       3.2   菲林氏溶液氧化还原滴定法是葡萄糖的测定中较为常用的测定方法，但其他具有还原能力的单糖会干扰测定结果，因此本实验参考了食品中葡萄糖含量的测定方法，采用了专一性较强的葡萄糖氧化酶－过氧化物酶法，使得 β葡聚糖的测定更加准确，迅速。
       3.3  本方法操作简便，准确度高，为进一步研究 β葡聚糖与灰树花多糖活性之间的关系奠定了基础。同时对于一些真菌多糖和植物多糖中的 β葡聚糖的测定也具有一定的参考价值。
       　　参考文献：
       ［1］  边  杉，叶波平，奚  涛，等. 灰树花多糖的研究进展［J］. 药物生物技术，2004，11(1)：60.
       ［2］  李小定，荣建华，吴谋成，等. 灰数花多糖的抗肿瘤活性及对免疫功能的影响［J］. 中药材，2003，26（1）：31.
       ［3］  Hirotada Kurushima, Noriko Kodama, Hiroaki Nanba. Activities of polysaccharides obtained from Grifola frondosa on insulin-independent diabetes mellitus induced by streptozotocin in mice［J］. Mycoscience，2000, 41: 473.
       ［4］  翟彤宇，杨  容，李坤英，等. 奶制品葡萄糖含量的酶法分析［J］. 食品科学，2003，24(1)：110.
       (南京工业大学 制药与生命科学学院，江苏 南京  210009；中国药科大学生命科学与技术学院，江苏 南京  210009）