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       【摘要】 
       目的建立液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)测定小鼠肝、心、脾、肺、肾组织中龙胆苦苷浓度的方法，为其组织分布研究奠定基础。方法样品处理采用固相萃取法，内标物扑热息痛，色谱柱: Kromasil C8柱(3.5μm，2.1 mm×150 mm)，流动相为甲醇-1%甲酸溶液-乙腈(60∶30∶10)，流速170 μl·min-1，用ESI离子化和正离子多离子反应监测方式检测。结果该法测定龙胆苦苷在组织中线性范围为3～3 000 ng·ml-1，检测限3 ng·ml-1，色谱峰保留时间为2.40 min，各组织方法回收率均在89.2%～107.2%，批内、批间精密度RSD值小于12%，提取回收率大于78%。结论该方法准确、方便、快速、灵敏度高，适用于大批量组织样品中龙胆苦苷含量测定。
       【关键词】  龙胆苦苷; 液相色谱-串联质谱; 组织; 测定
       Determination of Gentiopicroside in Mouse Tissue by HPLC-MS/MS
       ZHAO Ying1，FENG Yi2 ，ZHAO Ruizhi2*
       (1. 07 Graduate student of Guangzhou University of TCM, Guangzhou 510006, China ; 2.The Second Affiiated Clinical Hospital, Guangzhou University of TCM, Guangzhou 510006, China)
       Abstract：ObjectiveTo establish LC-MS/MS determination method of gentiopicroside in liver, heart, spleen, lung and kidney in mice. MethodsTissue samples were prepared based on solid-phase extraction with Paracetamol as internal standard, and separation was made through a Kromasil C8 column (3.5μm, 2.1 mm×150mm), the mobile phase consisted of methanol-1% Formic acid -acetonitrile (60:30:10) with the flow rate of 0.17 ml·min-1. The sample was detected by the positive electrospray ionization (ESI)-MS method under multiple reaction monitor (MRM) mode.ResultsThe linearity of gentiopicroside ranged from 3 to 3000 ng·ml-1, the detection limit was 3 ng·ml-1. The recovery of this method ranged from 89.2%～107.2%. The value of RSD of intraday and interday was less than 12%. Mean recovery rate was more than 78%. ConclusionThe method is accurate, simple and effective for the simultaneous determination of gentiopicroside in tissue of mice.
       Key words： Gentiopicroside; LC-MS/MS; Tissue; Determination
       龙胆苦苷(Gentiopicroside)具有促进胃分泌、保肝、抗炎等作用[1], 是常用中药秦艽和龙胆中的主要活性成分。建立其组织样品中含量测定方法，了解其组织内分布对于指导临床合理用药以及理解其药性具有积极意义。
       目前关于龙胆苦苷分析方法的报道大多是血液或体外样品测定，由于组织成分复杂，有酶等多种生物活性物质存在，影响药物的稳定性及提取效率，因此组织样品处理有其特殊之处。冯英菊等[2]曾建立了大鼠组织样品中龙胆苦苷含量测定方法，其最低检测限为500 ng·ml-1，药代研究动物给药量120 mg·kg-1，龙胆临床常用量仅9 g，其用量远低于文献的给药量，而由于药物体内分布及药效与剂量相关[3]，高剂量下组织分布的结果难以代表临床的效果。为研究龙胆苦苷组织内药代与药效关系，本实验建立了液相色谱—串联质谱 (LC-MS/MS)法测定小鼠灌胃给药后肝、心、脾、肺、肾组织中龙胆苦苷的浓度，以期为龙胆苦苷的体内分布及代谢动力学研究奠定基础。
       1 材料与仪器
       1.1 动物KM小鼠，♂，体质量25～28 g，广东省医学实验动物中心提供(动物合格证号：0053981)。
       1.2 仪器API3000型液相色谱-三级四极杆质谱联用仪：配有电喷雾离子源(ESI)，AB公司，美国; 1100液相色谱系统，美国Agilent公司;超低温冰箱(NEW BRUNSWICK 英国);电子天平(BS224 S 北京赛多利斯仪器系统有限公司);IKA涡漩震荡仪(GENIUS 3)和IKA匀浆仪(T10);白洋台式离心机(G20 河北省安新县白洋离心机厂);Waters 20 管型固相萃取仪(美国Waters公司);waters HLB 固相萃取小柱(1cc/30 mg,美国Waters公司);Milli-Q 纯水机(美国Millipore公司)。
       1.3 试剂与药品龙胆苦苷对照品(HPLC>98%，成都普思生物科技有限公司，批号: ps 08012501);扑热息痛对照品(HPLC>99%，上海融禾医药科技有限公司,批号：090106);甲醇(HPLC级，天津市四友精细化学品有限公司);甲醇、乙腈(HPLC 级，KYUNGKIDO公司 韩国);甲酸(HPLC级，天津市科密欧化学试剂有限公司)。
       2 方法
       2.1 色谱条件色谱柱为Kromasil C8, (3.5 μm，2.1 mm×150 mm);流动相为甲醇-1%甲酸溶液-乙腈(60∶30∶10);流速170 μl·min-1 ;柱温为室温;进样20 μl。
       2.2 质谱条件电喷雾ESI源，喷雾电压IS 3 000 V，雾化温度300℃，雾化气NEB(GAS1) 6 L·min-1，加热辅助气AUX(GAS2) 7.0 L·min-1，帘气CUR 15 L·min-1， 碰撞气CAD 6 L·min-1，去簇电势DP 8 V，聚焦电势FP 150 V，检测方式为正离子多离子反应监测(MRM)，用于定量分析的母子离子对分别为龙胆苦苷(m/z 374.1→195.2)，内标物扑热息痛(m/z 152.0→110.1)。见图1～2。
       2.3 标准品溶液、内标液的配制精密称取龙胆苦苷对照品适量，至10 ml容量瓶中，用70%甲醇溶解成1 mg·ml-1的对照品储备母液，再用70%甲醇稀释成浓度分别为100，10，1 μg·ml-1的对照品次级母液;精密称取扑热息痛适量，用70%甲醇溶解并稀释成1 μg·ml-1溶液作内标液。
       图1 龙胆苦苷全扫描(A)与子离子(B)扫描图
       图2 内标扑热息痛全扫描(A)与子离子(B)扫描图
       2.4 给药与样品采集18只雄性昆明种小鼠，随机分为3组，每组6只，按50 mg/kg灌胃给予龙胆苦苷后，给药后于15 min，30 min，240 min眼球取血后，迅速取出肝、心、脾、肺、肾各组织，用生理盐水洗净残血，吸干水分于-80℃冰箱中冻存待处理。
       2.5 样品处理
       2.5.1 样品准备将组织室温下解冻后，称重，加水匀浆(肝、肾-水1∶20;脾-水1∶15;心、肺-水1∶10)，制备组织匀浆液待用。
       2.5.2 处理方法固相萃取小柱用1.0 ml甲醇活化后用1.0 ml纯水平衡，取组织液200 μl加入纯水200 μl和内标溶液50 μl，漩涡混匀后上样，过柱后用纯水1.0 ml洗涤，抽干并弃去洗涤液，再用甲醇1.0 ml洗脱收集，取洗脱液200 μl加入适当溶剂，调成流动相比例，混匀后用0.22 μm微型滤器过滤，取20 μl进样。
       3 结果
       3.1 方法专属性上述测定条件下，组织中龙胆苦苷保留时间约为2.40 min，内标物扑热息痛保留时间约为2.38 min，与龙胆苦苷相近，其中内源性物质不干扰两者的测定，以肝脏组织为例，色谱图见图3。
       其它组织专属性图与肝脏组织相近。
       3.2 标准曲线及线性范围取空白组织浆液，加入龙胆苦苷标准品溶液配制成浓度为3，10，30，100，300，1 000，2 500，3 000 ng·ml-1的标准品组织浆液，按“2.5.2”项下方法处理样品，以龙胆苦苷峰面积与内标物峰面积之比(Y)对浓度(X)进行回归分析(权重1/x2)，得各组织龙胆苦苷浓度在3～3 000 μg·ml-1线性关系良好，检测限均为3 ng·ml-1，各组织回归方程及相关系数见表1表1 各组织标准曲线及相关系数
       3.3 精密度与准确度取空白组织浆液加入龙胆苦苷标准品溶液适量，配制成10，1 500和2 500 ng·ml-1的低、中、高浓度质控样品，各浓度5份样品按“2.5.2”项下方法操作，测定，日内进样，求算日内精密度;此法重复测定3 d，求日间精密度。结果见表2;将实测值与真实值相比得方法回收率表示准确度。结果见表3表2 各组织龙胆苦苷精密度
       3.4 提取回收率取空白组织浆液加入龙胆苦苷标准品溶液适量，配制成10，1 500和2 500 ng·ml-1的低、中、高浓度质控样品(n=5)，按“2.5.2”项下方法处理，另取龙胆苦苷及内标扑热息痛对照品加入到空白组织浆液经SPE法萃取后的洗脱液中，使其绝对含量与上述质控样品中药物含量相等，各浓度5份样品，测定，质控样品峰面积平均值与对应浓度样品比较，得本法的提取回收率(见表4)。各脏器中龙胆苦苷提取回收率均大于78%，内标提取回收率大于88%表4 各组织龙胆苦苷提取回收率
       3.5 稳定性本实验条件下，各组织低、中、高浓度质控样品经3次冷冻-融解循环和-80℃保存3个月，处理后进样，其测定值与真实值比较，相对偏差均<15%，表明样品均可保持稳定;处理后的待测液在4℃冰箱放置16 h及在自动进样器中放置8 h，经测定均稳定。
       3.6 龙胆苦苷灌胃给药后各组织浓度小鼠按50 mg·kg-1剂量灌胃给予龙胆苦苷后15，30，240 min组织中药物浓度结果见表5表5 各时间点龙胆苦苷在各脏器中的浓度
       4 讨论
       样品处理是影响测定结果的重要因素，文献报道的方法有甲醇沉淀蛋白法、液液萃取及固相萃取法等。本实验曾比较了甲醇沉淀法、液液萃取法及固相萃取法对龙胆苦苷提取回收率的影响，结果发现虽然3种处理方法均可达到70%～80%的萃取回收率，但甲醇沉淀蛋白后，LC/MS/MS检测，生物基质效应明显，所含杂质较多，严重影响其检测灵敏度;醋酸乙酯1∶10液液萃取需提取两次，操作复杂，不适用大批量的生物样品测定;相比之下固相萃取法，回收率高、操作简便，生物基质干扰少，灵敏度高，可实现批量处理，提高样品处理效率。因此，我们选择了固相萃取法作为样品处理方法。
       良好的精密度、准确度、重复性是保证实验结果的关键，本实验所建立的LC-MS/MS方法，定量范围为3～3 000 ng·ml-1，检测下限为3 ng·ml-1， 可满足组织样品对于准确度、灵敏度，重复性等的要求;分析速度是影响实验成本及工作效率的重要因素，与以往的龙胆苦苷组织测定方法[2]相比，本方法分析时间缩短，仅为3.5 min，溶剂用量大幅度减少，在提高效率的同时还节约了大量分析样品的成本，适宜于大量样品的组织分布实验的研究。
       【参考文献】
         　[1] Wang C,Cheng X,He Y. Pharmacokinetic behavior of gentiopicroside from decoction of radix gentianae,gentiana macrophylla after oral administration in rats:a pharmacokinetic comparison with gentiopicroside after oral and intravenous administration alone[J].J Arch Pharm Res ，2007, 9(30):1149.
       
       [2] 冯英菊，杨甫昭，孙文基，等.龙胆苦苷在大鼠体内的组织分布研究[J].现代中医药，2004，5：1.
       
       [3] Stumpf WE. The dose makes the medicine[J].J Drug Discov Today，2006, 11-12(11): 550.