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       【摘要】 
       目的研究甘草根中Cu、Fe、Mn、Ca、Mg、Zn 6种元素的次级形态。方法按照元素次级分析流程，分别用732阳离子交换树脂、Chelex-100螯合树脂、Amberlite XAD-2型大孔吸附树脂，将甘草根中Fe、Zn、Cu、Mn、Ca、Mg分为游离态和非游离态、稳定态与不稳定态、有机态与无机态6种形态，火焰原子吸收测定各形态中各元素含量。结果甘草根中Cu、Mn、Ca、Mg 4种元素主要以游离态存在，Cu、Mn、Ca、Mg、Zn稳定态含量均大于50%，且Cu、Mn、Ca、Mg、Zn元素大部分以无机态形式存在。结论甘草中上述6种元素以游离态与非游离态、稳定态与不稳定态、有机态与无机态等多种形态共存。
       【关键词】  乌拉尔甘草; 元素; 次级形态分析
       Secondary-Level Speciation Analysis for Several Elements in Glycyrrhiza
       LIANG Xinhua1,2, LI Mengju3, ZHENG Caixia1, LI Aihua2
       (1. College of Biological Sciences and Biotechnology, Beijing Forestrial University, Beijing, 100083, China; 2. School of Life Science, Ningxia University, Yinchuan, 750021, China; 3.Tanglai High School, Yinchuan, 750001, China)
       Abstract：ObjectiveTo study secondary-level speciation of Cu,Fe,Mn,Ca,Mg,Zn in roots of Glycyrrhizia uralensis Fisch..MethodsThe six elements Cu,Fe,Mn,Ca,Mg,Zn in the roots of manual cultured Glycyrrhizia uralensis Fisch. were extracted based on traditional secondary analytical flow chart program and separated into dissociative and non-dissociative, stable and unstable, organic and inorganic forms by means of 732 cation exchange resin, 100 chelating resins and XAD-2 resins. Contents of Cu,Fe,Mn,Ca,Mg,Zn in each form was detected by flame atomic absorption sepctrophotometry (FAAS). ResultsThe contents of Cu、 Mn、Ca、 Mg and the contents of Cu、Mn、Ca、Mg and Zn in dissociative and stable forms were more than 50%, majority of Cu、Mn、Ca、Mg and Zn were in inorganic forms.Conclusion The second forms of Cu、Fe、Mn、Ca、Mg Zn in the roots of manual cultured Glycyrrhizia uralensis Fisch. are presented in dissociative and non-dissociative, stable and unstable, organic and inorganic forms at the same time.
       Key words：Glycyrrhizia uralensis Fisch.; Element; The second speciation analysis
       甘草为常用的大宗药材，来源于豆科(Leguminosae)植物甘草(又名乌拉尔甘草)G. uralensis Fisch.。中医认为甘草性平、味甘，具有补脾益气、清热解毒、润肺止咳、缓急止痛、调和诸药的功效。近年来越来越多的研究认为中药发挥药效与中药中微量元素有着密切的关系。对于中药中微量元素的研究，不但要考虑种类和含量的高低，更重要的是要研究它们的存在状态。
       目前，对于中草药初级形态分析的研究较多，而对于中草药次级形态分析的研究很少[1～6]，其中对中草药甘草中微量元素的次级形态分析的研究少见报道。本研究对甘草中的铜、锌、锰、铁、钙和镁6种元素的次级形态进行了分析，以期为研究甘草中微量元素与甘草药效间的关系、进一步进行更高层次的元素形态分析以及新药的开发、研制等奠定一定的理论基础。
       1 仪器与试剂
       TAS——990super AFG型原子吸收分光光度计(北京普析通用);Mg，Ca，Fe，Zn，Cu，Mn 6种元素空心阴极灯(北京普析通用);烘箱;电子分析天平;中草药粉碎机。宁夏盐池人工种植2年生乌拉尔甘草根于2008-10采集(经本学院植物学专业王俊教授鉴定)，用去离子水洗净，切段，干燥，粉碎过40目筛后瓶装保存备用。HNO3、HClO4、HCl均为优级纯(北京化工厂)，无水乙醇分析纯(北京化工厂);去离子水(Ω>15M);Mg、Ca、Fe、Zn、Cu、Mn标准溶液由宁夏217核工业中心实验室提供;0.45 μm微孔滤膜(上海半岛);732阳离子交换树脂(北京北实科技)，Chelex-100螯合树脂(Sigma公司)，Amberlite XAD-2型大孔吸附树脂(Sigma公司)。
       2 方法
       2.1 原子吸收分光光度计工作条件原子吸收分光光度计采用空气—乙炔火焰，具体分析测定条件见表1。
       2.2 次级形态分析方法
       2.2.1 树脂的前处理
       732阳离子交换树脂的处理：依次用铬酸、醇、NaOH、HCl浸泡，以除去树脂中的杂质，最后用去离子水冲洗至中性后，将树脂浸泡于去离子水中备用。
       吸附树脂的处理：将Amberlite XAD-2型大孔吸附树脂用2倍左右体积的无水乙醇浸泡2 h，不时搅动使树脂充分溶胀。依次用醇、碱、酸、醇浸泡，最后用去离子水冲洗至中性。
       螯合树脂的处理：粒径约为0.03～0.07 mm，Na+型。用浓度6 mol·L-1的HCl浸泡48 h以除去杂质，并使树脂溶胀，此时树脂为H+型。用NaOH洗涤，将树脂转为Na+型，最后用去离子水冲洗至中性后，将树脂浸泡于去离子水中备用。表1 分析条件及回归方程
       2.2.2 次级形态分析流程见图1。
       2.2.3 可溶态的测定准确取2 ml可溶态溶液，按AAS法进行消化和测定。
       2.2.4 游离态与非游离态的分离和测定准确取2 ml可溶态溶液，调节其pH为5.5后，过阳离子交换树脂，用去离子水(每次10 ml洗涤3次)洗涤树脂，收集流出液和洗涤液并将其合并，加热浓缩至约1 ml，进行消化和测定，得到各元素的非游离态含量。用2 mol·L-1的HCl(每次10 ml洗涤5次)洗脱树脂，收集洗脱液，加热浓缩至1 ml，进行消化和测定，得到各元素的游离态含量。
       2.2.5 有机态与无机态的分离和测定 准确取2 ml可溶态溶液，调节其pH为4.0后，过Amberlite XAD-2型大孔吸附树脂，用1%HNO3(每次10 ml洗涤8次)洗涤树脂，收集流出液和洗涤液并将其合并，加热浓缩至约1ml，进行消化和测定，得到各元素的无机态含量。用无水乙醇(每次10 ml洗涤3次)洗脱树脂，收集洗脱液，加热浓缩至1 ml，进行消化和测定，得到各元素的有机态含量。
       图1 次级形态分析流程图
       2.2.6 稳定态与不稳定态的分离和测定准确取2 ml可溶态溶液，调节其pH为6.0后，过Chelex-100螯合树脂，用去离子水(每次10 ml洗涤3次)洗涤树脂，收集流出液和洗涤液并将其合并，加热浓缩至约1 ml，进行消化和测定，得到各元素的稳定态含量。用2 mol·L-1的HCl(每次10 ml洗涤5次)洗脱树脂，收集洗脱液，加热浓缩至1 ml，进行消化和测定，得到各元素的不稳定态含量。
       2.2.7 次级形态分布的导出方式如下：令Wi 、Pi(i=F、F-Ⅰ…)分别表示某级分的总重量及某元素在该级分中的含量。
       [F] = WF · PF/WA · PA
       [F-Ⅰ]= WF-Ⅰ · PF-Ⅰ /WF · PF
       [F-Ⅰ] -[F-Ⅵ]的规定与[F-Ⅰ]相同，均表示成百分数。
       3 结果
       从表2中可见，盐池甘草根可溶态中Cu、Fe、Mn、Ca、Mg 、Zn元素含量分别为1.18，12.34，4.98，1 528.96，102.60，9.64 mg/kg。其中Ca、Mg两元素的含量远高于其他4种元素，说明这2种元素比其他4种元素更易于提取。表2 甘草根中元素次级形态分析　，从表2和表3可知, 甘草可溶态中Cu，Fe，Mn，Ca，Mg，Zn是各以某种形态为主的多种形态共处混杂体系。其中Cu，Mn，Ca，Mg 4种元素均以游离态为主要存在形式(游离态含量均大于50%)，Zn，Fe两元素则以游离态和非游离态共存。Cu，Mn，Ca，Mg、Zn元素无机态含量均大于50%。甘草可溶态中除Fe元素外其余5种元素的稳定态分布也都大于50%。甘草中主要药效成分为甘草酸、甘草多糖和黄酮类等物质，而Fe主要是呈有机态存在，其他元素也存在一定比例的有机态，因此，研究Fe及其他元素是否与上述成分形成络合物或进行Fe更高层次的形态分析将具有一定重要意义。
       表3 甘草根中元素次级形态分布.
       4 讨论
       次级形态分析的目的是在初级形态分析已确定有关元素种类及提取情况的基础上，进一步探讨它们在可溶态中发挥作用的形式。
       本实验中，用精密酸度计测得甘草根可溶态的pH为4.8。各树脂条件的选择是次级形态分析的关键。参阅有关文献[7]并经实验验证后，确定各树脂条件如下：①732强酸性阳离子交换树脂：实验酸度环境选用pH为5.5;洗脱液为2 mol·L-1的盐酸;洗脱液用量为10 ml×5。②Amberlite XAD-2型大孔吸附树脂：实验酸度环境选用pH为4.0;洗涤液为1%的硝酸(10 ml×8);洗脱液为无水乙醇;洗脱液用量为10 ml×3。③Chelex-100螯合树脂：实验酸度环境选用pH为6.0;洗脱液为5 mol·L-1的盐酸;洗脱液用量为10 ml×5。
       在研究中, 离子交换是常用的分离手段，其优点在于操作简便、污染少、样品破坏小。采用阳离子交换树脂可以富集溶液中的“自由”金属离子，而非游离态的离子直接流过树脂不被吸附。对树脂内和流出液的金属含量通过原子吸收分光光度计进行测定，可得到元素的游离态和非游离态的含量。使用Amberlite XAD-2大孔树脂，由于Amberlite XAD-2大孔树脂是一种中性的非极性多孔苯乙烯和二乙烯共聚物形成的大网状树脂，树脂的非极性表面能与有机化合物的疏水基团相互作用，从而能选择性的吸附水溶液中的有机化合物，把元素有机态和无机态相互分离开来[8]。本实验中选用Amberlite XAD-2大孔树脂对甘草根中6种元素的有机态和无机态进行分离，取得了良好的分离效果。本实验在分离稳定态和不稳定态时使用的是Na+型树脂Chelex-100螯合树脂。螯合树脂的活性基团明显受pH的影响。一般来说，树脂对金属离子的交换能力随溶液pH上升而增大，但不宜大于11，否则会水解产生沉淀。本实验中选择pH为6.0，获得了良好的分离效果。Chelex-100螯合树脂的孔径大约为1.5mm，胶体颗粒的直径比树脂孔径大，所以溶液流经树脂时，胶体状态的金属元素就不会被吸附，这样通过螯合树脂就可以把胶体颗粒及不易离解的金属离子络合物与离子态及易离解的络合物分离开[9]。
       【参考文献】
         　　[1] 沈晓芳,张 勇,杨 成，等.黄芪中微量元素的分析[J].分析化学,2006,34(3):396.
       
       [2] 姜 艳,韩 鹏.人参中微量元素的次级形态分析[J].现代中西医结合杂志,2009,18(5):556.
       
       [3] 胡雪梅,郭荣辉,李 晖.川芎中锌锰铁钙镁元素的次级形态分析(I)[J].微量元素与健康研究，2005,22(1):16.
       
       [4] 曾志将,颜伟玉,王开发.花粉中Fe、Zn、Cu、Mn元素次级形态分析研究[J].上海交通大学学报(农业科学版)，2002,20(2):90.
       
       [5] 胡雪梅,陈风雷,陈 丽,等.川芎中锌锰铁钙镁元素的次级形态分析(II)[J].微量元素与健康研究,2006,23(5):21.
       
       [6] 罗娅君,张新申,肖新峰，等.大叶金花草中微量元素的次级形态分析[J].化学研究与应用,2006,18(4):390.
       
       [7] 胡学梅,谭光群,李 晖.治疗心血管疾病中草药中微量元素的测定[J].四川大学学报(工程科学版)，2003,35(1):109.
       
       [8] 魏金玺.无机痕量元素的形态分析[J].化学通报,1985,2:1.
       
       [9] 周天泽.无机微量元素形态分析方法学简介[J].分析试验室,1991,10(3):44.