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       【摘要】 
       目的研究消瘤保肺丸对上皮细胞钙粘蛋白(E-cadherin)、α-catenin及β-catenin在人肺癌PG细胞株中表达的影响及其意义。方法采用免疫组化链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶法(SP法)检测人肺癌PG细胞E-cadherin、α-catenin及β-catenin在消瘤保肺丸干预作用下的表达情况。随机分为4组即消瘤保肺丸高剂量组、消瘤保肺丸低剂量组、清肺化痰丸组和空白组。结果E-cadherin与α-catenin、β-catenin在消瘤保肺丸作用下阳性表达率不同，其中E-cadherin在消瘤保肺丸的影响下阳性表达率较低，明显低于清肺化痰丸组和空白(P<0.01);而α-catenin、β-catenin在消瘤保肺丸干预作用下阳性表达率较高，且高于清肺化痰丸组和空白组(P<0.01)。结论消瘤保肺丸对E-cadherin、α-catenin及β-catenin的表达影响显著，提示其对肺癌的侵袭转移有一定抑制作用，从而表明E-cadherin、α-catenin及β-catenin的表达与肺癌的进展和转移密切相关。
       【关键词】  消瘤保肺丸; 上皮细胞钙粘蛋白; α-连接素; β-catenin; 人肺癌PG细胞; 免疫组化法
       肺癌患者的肿瘤转移是导致其死亡的重要原因之一。粘附是肿瘤转移过程中的一个关键环节，粘附因子在其中发挥着不可或缺的作用。上皮细胞钙粘蛋白(E-cadherin)是一类细胞粘附的跨膜糖蛋白，是维持上皮细胞形态及同种细胞间粘附连接的主要粘附分子，E-cadherin借助于α-连接素(α-catenin)连接在E-cadherin与β-catenin之间，大量的实验证实E-cad/catenins复合物介导的细胞同质粘附具有抑制肿瘤侵袭、转移的作用[1,2]。我们针对该环节，研究消瘤保肺丸含药血清对E-cadherin、α-catenin及β-catenin表达水平的影响，以探讨中药抗癌转移的作用机制。
       1 材料与仪器
       1.1 药物消瘤保肺丸，该药由河南省中医院院内制剂室提供，批号：20070514;清肺化痰丸，昆明中药厂有限公司，国药准字Z53020763，批号：080119。
       1.2 动物及瘤株日本大耳白兔8只，购于河南省动物实验中心;PG 细胞(即人高转移性巨细胞肺癌细胞株)，由北京广安门医院肿瘤实验室提供。
       1.3 试剂RPMI-1640培养基，美国Gibco公司，编号1313945;优级胎牛血清，天津TBD公司，编号Df-1055;E-cadherin抗体，美国Santa cruz公司，编号MSC8426;α-catenin抗体，美国Zymed公司，编号80900705;β-catenin抗体，美国Santa cruz公司，编号D0708;免疫组化SP-9002试剂盒，北京中杉金桥生物技术有限公司，编号51182001;DAB显色试剂盒，北京中杉金桥生物技术有限公司，编号375230AJ。
       1.4 仪器 二氧化碳培养箱HF90型，上海力新HEAL FORCE;电热恒温培养箱HH-B11-600型，国营创新医疗器械厂;生物显微镜XSP-8F型，广西梧州中康贸易有限公司;倒置显微镜CK40，日本Olympus公司;电动离心沉淀机，大连医疗器械厂，LD-6-4。
       2 方法
       2.1 动物分组、模型建立与含药血清制备8只健康日本大耳白兔，随机分为消瘤保肺丸高剂量药物组、低剂量药物组，清肺化痰丸对照组、空白组4组(依次简称为消高组、消低组、清肺组、空白组，以下同)，每组2只，每组每天早晚各给药1次，每次10 ml/kg，其中高、低剂量组分别相当于人等效剂量的10、5倍，空白组给以等量生理盐水，连续给药3 d。取兔血制备为含药血清，具体制备过程参照文献[3]。
       2.2 细胞培养、给药复苏PG冻存细胞，培养基选用含20%优级胎牛血清的RPMI-1640培养基，隔日或每日换液1次，选对数生长期细胞至基本贴满下壁，细胞传代，每培养瓶中加2 ml的0.25%胰蛋白酶液使细胞脱壁，加入8 ml培养基，反复吹打后分入5 ml至新培养瓶。
       将干净盖玻片放于培养皿，0.1% 多聚赖氨酸液浸泡24 h，PBS缓冲液浸泡2 s后取出放入6孔板，每孔一张玻片。向每瓶加0.25% 胰蛋白酶液使细胞脱壁，分别加入20% 消高组、消低组、对照组及空白组培养基，将细胞浓度调至2×106/L制成细胞悬液，每组加入一6孔板中，每孔加入1 ml细胞悬液，放37℃ CO2培养箱培养48 h。第3天观察细胞贴壁状态，取出盖玻片，经10%多聚甲醛固定20 min后免疫组化用。
       2.3 免疫组化SP法参照试剂操作说明书:在盖玻片上滴加去离子水(H2O2)1滴，常温放置湿盒中30 min。PBS缓冲液浸泡3次，5 min/次。滴加山羊封闭血清1滴，常温放置湿盒中30 min。甩掉血清，滴加目的一抗1滴，放湿盒中置4℃冰箱过液。PBS缓冲液浸泡3次，5 min/次。滴加二抗工作液1滴，放湿盒中置37℃电热恒温培养箱孵育15 min。PBS缓冲液浸泡3次，5 min/次。滴加链霉卵白液1滴，放湿盒中置37℃电热恒温培养箱孵育15 min。PBS缓冲液浸泡3次，5 min/次。DAB显色剂加1～2滴染色30 s，观察染色情况。清水冲洗10 min。苏木素加1滴染色5 min，清水冲洗10 min。盐酸酒精分化2 s，显微镜下观察，苏木素染色不满意可复染。细胞按50% 乙醇，70% 乙醇，95% 乙醇，无水乙醇的顺序脱水，每个浓度中浸泡5 min(无水乙醇分别浸泡两次)。二甲苯浸泡2次，每次5 min。中性树胶封片于载玻片上。
       2.4 判断方法 依据阳性细胞所占比例分为3个等级：①阴性(-)，细胞膜无棕色染色或细胞膜染色阳性细胞数<10%;②弱阳性(±)，细胞膜浅棕色，阳性细胞数10%～50%;③阳性(+)，细胞膜棕黄色或棕褐色，阳性细胞数>50%。随机取10个高倍镜下视野，判断每个视野下细胞表达情况并记录。见图1～3。
       aPG细胞消瘤保肺丸高剂量组 bPG细胞消瘤保肺丸低剂量组
       cPG细胞清肺化痰丸组 dPG细胞空白组
       图1 E-cadherin在肺癌PG 细胞各组的免疫组化表达(SP,400×)
       aPG细胞消瘤保肺丸高剂量组 bPG细胞消瘤保肺丸低剂量组
       cPG细胞清肺化痰丸组 dPG细胞空白组
       图2 α-catenin在肺癌PG细胞各组的免疫组化表达(SP,400×)
       aPG细胞消瘤保肺丸高剂量组 bPG细胞消瘤保肺丸低剂量组
       cPG细胞清肺化痰丸组 dPG细胞空白组
       图3 β-catenin在肺癌PG 细胞各组的免疫组化表达(SP,400×)
       2.5 统计学处理采用SPSS 13.0统计软件处理，等级资料，以阴性、弱阳性及阳性表达的视野个数分别表示。统计方法选用秩和检验。
       3 结果
       见表1表1 人肺癌PG中E-cadherin、α-catenin及β-catenin阳性表达的视野个数统计
       4 讨论
       消瘤保肺丸是从众多方药中筛选出的有效方剂，由浙贝母、蜂房、北沙参、南沙参、黄芪等药物组成，功能化痰止咳、益气养阴、抗癌解毒。其中浙贝母清热化痰止咳、散结消痈;半夏不仅除湿化痰、发表开郁、降逆止呕，且具有消淤止血、消肿散结之功[4]。两药合用可使痰化郁开而咳止，同时兼具止血之功，黄芪补气升阳、益卫固表，补肺气之不足;南沙参、北沙参养阴清肺，益胃生津，可使肺热得清，阴津滋生，与黄芪共达气阴双补之功;百合、麦冬滋阴益肺，滋而不腻，补而不燥;黄芩清肺止咳;仙鹤草不但可提高机体免疫机能，还可防治肺癌咳血[5]。前期实验证实消瘤保肺丸能提高免疫抑制小鼠腹腔巨噬细胞的功能，临床观察表明可以提高机体免疫功能， 配合化疗可提高临床疗效， 减轻化疗引起的骨髓抑制[6]。本实验表明，消瘤保肺丸含药血清对粘附分子在人肺癌PG细胞中的表达均有影响，且P<0.01。其中E-cadherin在正常肺癌细胞的阳性表达率较低，说明E-cadherin的表达与细胞的转移能力呈负相关;α-catenin,β-catenin则相反。消瘤保肺丸对粘附分子的阳性表达影响优于空白组，表明消瘤保肺丸对PG细胞的侵袭、转移有明显的抑制作用。消瘤保肺丸高剂量组与低剂量组大多差异显著，表明此中成药的药量增高对PG细胞的干预作用更有意义。综上所述，消瘤保肺丸有明显的抗肿瘤侵袭、转移作用。
       另外，我们不能忽略清肺化痰丸组在某些分子的表达中亦与空白组有显著差异。纵观二药，消瘤保肺丸与清肺化痰丸的组成均以化痰药为多，然消瘤保肺丸辅以散结消淤之法，更有利于肺癌痰、淤之病因。笔者前期使用流式细胞仪、RT - PCR等方法已初步证实化痰类中药可提高粘附分子E - cad的表达水平，从而增加肿瘤细胞间的粘附能力，降低肿瘤细胞脱落进入周围组织和血管的机率[7]。由此我们认为，以化痰类药为主的中药方剂可能对肺癌的侵袭和转移机制有着明确的影响。
       【参考文献】
         　[1] Jou T，Stewart DB，Stappert J，et al. Gentic and bio-chemical dissection of protein linkages in the cadherin-catenin complex[J].Proc Natl Acad Sci，1995，92(11)：5067.
       
       [2] 杨剑锋，廖粤军. E-cadherin/catenins与肿瘤发生、侵袭及转移[J].南华大学学报 (医学版),2002，30(4)：392.
       
       [3] 郭雄明，薛 霞，谢忠忱，等.兔血清制备及兔来源细胞培养实验[J].实验动物科学与管理，2005，22(4)：10.
       
       [4] 何绍奇，朱步先，朱建华，等. 朱良春用药经验集[M].长沙：湖南科学技术出版社，2008：69.
       
       [5] 周宜强，韩照予.中药肺宝丹联合介入治疗非小细胞肺癌的临床观察[J].中医药管理杂志，2006，14(10)：61.
       
       [6] 周宜强.肺宝丹治疗中晚期非小细胞肺癌的临床与实验研究[J].中医药通报，2002，6(1)：26.
       
       [7] 孙宏新，蒋士卿.痰-粘附分子相关性理论与肿瘤转移[J].河南中医，2005，25(9)：8.