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       【摘要】 
       目的研究青蒿琥酯(artesunate,Art)对肿瘤细胞增殖的影响和机制。方法MTT法测定青蒿琥酯对HEPG-2细胞增殖的影响， ELISA方法研究Caspase-3的活性，DNA电泳观察细胞DNA的变化，免疫组化研究凋亡相关蛋白p53,bcl-2,bax的表达。结果青蒿琥酯作用细胞48 h后可明显诱导HEPG-2细胞凋亡，并影响Caspase-3,p53,bcl-2蛋白的表达。结论青蒿琥酯可明显抑制HEPG-2细胞的增殖，促进HEPG-2细胞的凋亡，其机制可能是通过激活Caspase-3的活性，以及调节p53，bcl-2蛋白的表达而实现的。
       【关键词】  青蒿琥酯; Casepase-3; P53
       青蒿琥酯(Art)作为一种含内过氧化基团的倍半萜内酯化合物，主要用于疟疾治疗。近年研究发现，其还具有抗肿瘤作用[1]。本实验以人肝癌HEPG-2细胞株为作用对象，研究青蒿琥酯对肿瘤细胞株相关基因和蛋白的影响。
       1 仪器与材料
       1.1 仪器全自动CO2孵箱(美国Thermo Formo)，倒置显微镜(日产)，雷勃MK3酶标仪，贝克曼荧光显微镜，凝胶成像分析系统(美国Bio-Rad)，DMR+Q550病理图象分析系统(莱卡公司)。
       1.2 试剂四唑盐(MTT)，二甲基亚砜(DMSO)均购自Sigma公司,青蒿琥酯购于桂林南药股份公司(批号060109);紫杉醇，上海华联制药厂生产，购于广西医科大学第一附属医院药剂科(批号060202)， Caspase-3检测试剂盒(碧云天生物技术研究所)，Annvie-FITC试剂盒(晶美生物公司)，P53-抗，bcl-2-抗,bax-抗(北京中杉生物技术开发有限公司)，细胞凋亡DNA 提取试剂盒(碧云天生物技术研究所)，DNA ladder(广州东盛生物技术开发有限公司)。
       1.3 细胞株和细胞培养人肝癌HEPG-2细胞株从广西医科大学实验中心病理科细胞室引进，培养在含10%小牛血清，含青、链霉素各100 u/ml的RPMI-1640培养液中，37℃、5%CO2饱和湿度条件下培养，0.25%胰蛋白酶消化传代。
       2 方法
       2.1 MTT法检测细胞的增殖活性采用MTT法，取对数生长期的HEPG-2细胞，按每孔细胞3×103～5×103个，190 μl接种于96孔培养板中，每组设6个复孔，12 h贴壁后加入各组药物，药物终浓度梯度为200，100，50 μg/ml，37℃ 、5%CO2饱和湿度下培养24，48，72 h，OD值测量波长为双波长570 nm/630 nm。以下列公式计算抑制率：抑制率=(1-加药组OD/对照组OD)×100%，实验重复3次。
       2.2 Caspase-3 活性的研究经过预处理后的细胞，每2×106个细胞的比例加100 μl裂解液，冰浴15 min，4℃,16 000 g，离心15 min，收集上清，采用Caspase-3 ELISA试剂盒，按说明书操作。由PNA不同浓度对应的OD值得出标准曲线，由样品空中OD值，根据标准曲线方程求得相应样品空中Caspase-3活性浓度。
       2.3 DNA LADDER的观察 收集Art处理48 h后的细胞，按照试剂盒说明书，提取细胞DNA，进行1.2%琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像分析系统下拍照。
       2.4 p53,bcl-2,bax等蛋白的研究免疫细胞化学法检测p53，bcl和bax的表达，按试剂盒说明依次操作，用PBS代替一抗作为阴性对照。
       3 结果
       3.1 IC50的测定每个浓度梯度的抑制率得出后，采用Bliss法求得Art作用HEPG-2细胞的24，48，72 h的IC50分别为(103.1±8.6)，(75.3±4.1)，(65.7±6.0) μg/ml[2]。
       3.2 caspase-3活性的改变测得OD值后，根据OD值由拟合的标准曲线求得相应样品空中活性Caspase-3的浓度(48 h)。与空白组比较，药物作用后细胞中Caspase-3浓度高于对照组(P<0.01)。
       3.3 DNA ladder的观察 细胞凋亡最主要的生化标志是内源性钙一镁离子依赖性核酸内切酶被激活，选择性降解染色体核小体间DNA，从而在琼脂糖凝胶电泳上可能呈现规则的、间隔180～200 bp的“DNA梯子”样条带。由图1可见，Art处理HEPG-2细胞48h后，进行琼脂糖凝胶电泳，随着药物浓度的加大，“DNA梯子”样条带逐渐清晰，呈一定的剂量依赖性。
       表1 Art作用后caspase-3的浓度　图1 Art处理后的电泳图
       3.4 免疫组化结果细胞染色评分参考薛宏伟等的方法[3]。本实验对HEPG-2肝癌细胞株的凋亡相关基因产物p53、bcl-2、bax蛋白进行了研究，结果发现，用青蒿琥酯(100 μg/ml)处理48h后的肝癌细胞，p53蛋白表达低于细胞对照组， bax表达高于对照组，差异有统计学意义。见图2及表2。
       4 讨论
       细胞凋亡是由基因编码调控的细胞主动自杀过程，肿瘤细胞凋亡相关蛋白和基因的研究是近年来肿瘤研究领域的热点。Caspase家族在介导细胞凋亡途径的过程中起着非常重要的作用，而Caspase-3是细胞凋亡最为关键的执行分子，因此，研究Caspase-3的活性，具有重要的意义[4]。
       本实验中各浓度青蒿琥酯作用后肿瘤细胞中caspase-3活性明显高于对照组(P<0.01)，说明药物作用后HEPG-2细胞中Caspase-3活性增强，据此可初步判断青蒿琥酯有促进HEPG-2凋亡的作用，其机制之一可能是通过激活Caspase-3的活性。同时本实验从肿瘤细胞DNA变化方面也证实细胞发生凋亡，青蒿琥酯作用细胞48 h后，凝胶电泳显示，随着药物浓度的加大，“DNA梯子”条带逐渐清晰。P53属于抑癌基因，正常的P53基因又叫野生型P53基因，对细胞分裂及增殖起负调空作用，基因突变导致P53基因功能失活。免疫组化结果显示，用青蒿琥酯(100 μg/ml)处理48 h后的肝癌细胞，P53蛋白表达低于细胞对照组(P<0.05)，bax表达高于对照组(P<0.05)，说明Art可能通过调节突变型P53基因，影响bcl/bax基因的表达等途径诱导肿瘤细胞凋亡。
       图2 免疫组化图片(20×)表2 免疫组化评分结果(+s)
       【参考文献】
         　[1] THOMAS EFFERTH, AXEL SAUERBREY.Molecular Modes of Action of Artesunate in Tumor Cell Lines [J]. Mol Pharmacol，2003，64:382.
       
       [2] 李 静，杨 斌，陈永顺，等.青蒿琥酯对人肝癌HEPG-2细胞增殖作用的研究[J].时珍国医国药，2008,19(4)：823.
       
       [3] 薛宏伟，潘祥麟,杨尚军，等.冬凌草乙素诱导GBC-SD细胞的凋亡及对BCl-2，P53， FAS/APO-1，Cmyc表达的影响[J]. 中国药理学通报，2003， 19(11): 1247.
       
       [4] 詹其敏.分子肿瘤学[M]. 北京：人民军医出版社， 2005：403.