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       【摘要】 
       目的采用高效毛细管电泳(HPCE)法测定脑得生软胶囊的指纹图谱。方法运行缓冲液：30 mmol/L硼砂-50 mmol/L磷酸氢二钠，pH9.98;操作电压15 kV，检测波长260 nm，柱温25℃，采用压力进样，进样时间8 s。分析时间25 min。结果指纹图谱中标示了16个共有峰，其峰面积之和大于总峰面积的90%，方法精密度、稳定性、重复性均符合指纹图谱有关规定。采用夹角余弦法，计算10批脑得生软胶囊指纹图谱相似度结果均在0.93～1.00之间，但不同厂家生产的脑得生片有较大差别。结论该方法为脑得生制剂的质量控制提供了依据。
       【关键词】  脑得生软胶囊; 指纹图谱; 高效毛细管电泳
       Fingerprint Analysis of Naodesheng Soft Capsules by HPCE
       WANG Guangzhong,LIU Yanju,ZHANG Ming,XIAO Jin, LIU Yanwen
       (Key Laboratory of Traditional Chinese Medicine Resource and Compound Prescription Hubei College of TCM, Ministry of Education, Wuhan 430065，China)
       Abstract：ObjectiveTo develop the fingerprint of Naodesheng soft capsules by HPCE.MethodsThe background electrolyte consisted of 30 mmol/L sodium borate and 50 mmol/L sodium hydrogen phosphate and its pH was 9.98 ,applied voltage was 15kV,operating temperature was 25℃, the detection wavelength was at 260 nm and the analysis time was 25min.Results16 peaks were indicated.The peak area of these components was over 90% of total area in the fingerprint.RSD of precision and reproducibility was in the range of 5%. The results of similarity evaluated by cosine were 0.93～1.00 from 10 batches,but that of 3 batches of Naodesheng tablets from the other manufacturers were different .ConclusionThe method may provide reliable foundation of quality control of Naodesheng preparation.
       Key words：Naodesheng soft capsules ; Fingerprint; HPCE
       脑得生软胶囊是根据脑得生丸(片)经工艺和剂型改革而来。脑得生丸(片)收载于《中国药典》2005年版Ⅰ部，由三七、川芎、红花、葛根、山楂等5味中药组成，具有活血化瘀、通经活络的功效。用于瘀血阻络所致的眩晕、中风，症见肢体不用、言语不利及头晕目眩;脑动脉硬化、缺血性脑中风及脑出血后遗症见上述证候者[1]。临床应用广泛,疗效确切。但其制备方法为传统生产工艺，质量可控性差、药物稳定性难以控制，因而对临床疗效和患者服用有较大的影响，不能适应现代临床用药要求。为此，本实验室对其活性部位进行了提取纯化[2]，在此基础上研制成脑得生软胶囊。本论文采用高效毛细管电泳(HPCE)法对脑得生软胶囊进行了指纹图谱研究，并对不同厂家生产的脑得生片进行了指纹图谱分析比较，为脑得生制剂的质量控制提供科学依据。
       1 仪器与试药
       Beckman P/A system5000型毛细管电泳仪(美国Beckman公司);融熔石英毛细管柱75 μm×57 cm(河北永年瑞沣色谱器件有限公司);十万分之一天平(Sartorius BP211D)。 脑得生软胶囊(实验室自制，批号070801，070901，071001，071213，071214，071215，080815，080817，080824，080826);脑得生片，市售;葛根素购自中国药品生物制品检定，批号110752-200209;硼砂、磷酸氢二钠、氯化钠、氢氧化钠为分析纯，乙腈、甲醇为色谱纯，水为重蒸水。
       2 方法与结果
       2.1 电泳条件运行缓冲液：30 mmol/L硼砂-50 mmol/L磷酸氢二钠，pH 9.98;操作电压15 kV，极性由正到负，检测波长260 nm，柱温25℃，采用压力进样，进样时间8 s。毛细管冲洗方法：开机后用0.1 mol/L氢氧化钠溶液冲洗2 min，运行缓冲液3 min，每次测定之间运行缓冲液冲洗2 min。
       2.2 对照品溶液的制备精密称定葛根素和芦丁对照品适量，用含0.5%氯化钠的60%乙腈溶液制成每毫升含50 μg的对照品溶液。
       2.3 供试品溶液的制备取脑得生软胶囊6粒(1 d剂量)，除去胶皮，取内容物置具塞锥形瓶中，加入0.5%氯化钠的60%乙腈溶液100 ml，超声处理30 min。放冷后摇匀，再以0.45 μm微孔滤膜滤过，取续滤液即得。
       2.4 测定方法 取供试品溶液，按“2.1”项下条件进行分析，考察60 min内供试品溶液的色谱分离情况，记录25 min色谱图。结果见图1图1 样品HPCE图谱
       2.5 方法学考察
       2.5.1 精密度与稳定性实验称取同一批号的样品，按供试品溶液的制备方法制备供试品溶液，按上述色谱条件测定5次(0，3，6，9，12 h)，记录相对保留时间和相对峰面积的比值，结果其共有峰相对保留时间的RSD均小于2%，共有峰的峰面积比值的RSD均不超过5%，符合指纹图谱的技术要求。
       2.5.2 重复性实验取脑得生软胶囊内容物5份，分别按供试品溶液的制备方法制备供试溶液，进样分析，其共有峰相对保留时间的RSD均小于2%，共有峰的峰面积比值的RSD均不超过5%，表明该方法的重复性良好。
       2.6 指纹图谱技术参数
       2.6.1 共有峰的标定根据10个不同批次脑得生软胶囊供试品的检测结果，比较其电泳图谱，在25 min之内各色谱峰分离良好，结果见图2。以相对保留时间标定共有峰16个，并以8号峰为参照峰S(葛根素峰)，设定参照峰的峰面积为1，计算其他各共有峰相对保留时间和相对峰面积，结果其共有峰相对保留时间的RSD均小于2%，共有峰的峰面积比值的RSD均不超过5%。结果见表1～2。
       图2 10个不同批次脑得生软胶囊指纹图谱叠加图
       表1 10批样品共有峰相对保留时间　表2 10批样品共有峰相对峰面积
       2.6.2 共有峰面积比值 计算非共有峰占总峰面积的比值，结果表明，其比值小于10%，符合指纹图谱的要求。
       2.6.3 主要色谱峰的鉴别 在相同色谱条件下，测定葛根素对照品及芦丁对照品，并与样品指纹图谱中相应图谱峰进行比较，发现样品指纹图谱中8号峰的保留时间与葛根素色谱峰吻合，11号峰的保留时间与芦丁色谱峰吻合，故样品指纹图谱中8、11号峰鉴定为葛根素和芦丁。
       2.7 相似度评价采用夹角余弦法，计算10批脑得生的相似度，结果如下：0.992，0.983，0.970，0.948，0.929，0.968，0.991，0.956，0.968，0.939。相似度结果存在着较小的差异，说明工艺的稳定性很好，生产10批脑得生软胶囊的质量稳定。
       2.8 脑得生软胶囊与3种市售脑得生片指纹图谱比较比较3种市售脑得生片与自制脑得生软胶囊指纹图谱，可以看出，市售3个不同产地脑得生中A制药厂和C制药厂生产的脑得生片的指纹图谱与自制脑得生软胶囊指纹图谱相似程度高，而B制药厂生产的脑得生片的指纹图谱则存在较大差异。见图3。
       采用夹角余弦法，计算4种脑得生制剂(A、B、C和自制)间的相似度，结果如下：0.881，0.792，0.910，0.948。相似度结果存在着较大的差异，且B制药厂生产的脑得生片的指纹图谱相似度小于0.8，而A、C制药厂与自制脑得生软胶囊指纹图谱的相似度接近，说明脑得生软胶囊与A、C两制药厂生产的脑得生片质量基本一致。
       图3 不同来源样品指纹图谱比较
       3 讨论
       高效毛细管电泳是近年来发展较快的一种高效分析技术，在中药研究中应用，越来越受到人们的重视。它具有高效、快速、进样体积小、溶剂消耗少和抗污染能力强等特点;分析中药样品时前处理过程简单，有时甚至无需处理，因此，在中药有效成分分析、指纹图谱研究等方面已显示出显著的优势。本研究采用高效毛细管电泳法(HPCE)，建立了复方脑得生软胶囊的指纹图谱，标定了16个共有峰，其峰面积达到90%以上，图谱清晰，其精密度试验、稳定性试验和重复性试验良好，各项技术参数符合相关规定[3]。
       实验中比较了195～500 nm所得的HPCE图谱，结果在260 nm波长检测时，其HPCE图谱中可见较多的色谱峰，同时各色谱峰分离度较好，故确定260 nm为检测波长。
       10批脑得生软胶囊和3种不同厂家脑得生的指纹图谱研究表明，自制10批脑得生软胶囊及A、C制药厂生产的脑得生片的指纹图谱的相似度高，但B制药厂生产的脑得生片的指纹图谱相似度小于0.8。结果说明，自制脑得生软胶囊工艺可靠、质量稳定;不同厂家的脑得生片质量有所不同，但多数是稳定一致的;所建立的指纹图谱为有效控制脑得生制剂的质量提供了参考依据。
       【参考文献】
         　[1] 国家药典委员会.中国药典，Ⅰ部[S].北京：化学工业出版社，2005：572.
       
       [2] 王光忠，李 桥，宋 恬，等.D-101树脂富集复方脑得生中总黄酮的工艺研究[J].中国中医药信息杂志，2009，16(7)：50.
       
       [3] 国家食品药品监督管理局.中药注射剂指纹图谱研究的技术要求(暂行)[Z].1999年.