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       【摘要】 
       目的建立鹿角脱盘蛋白提取工艺。方法采用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法(SDS-PAGE)，考察不同pH值、不同料液比、不同浸提时间、不同盐浓度等影响因素对蛋白提取效果的影响。结果鹿角脱盘蛋白的提取工艺为：pH值12的缓冲液(含50 mM EDTA、0.5 M NaCl)浸提，料液比为1∶5，浸提时间为3 h，浸提次数2次。结论验证实验结果表明，鹿角脱盘总蛋白收率可达2%，纯度可达80%。优选出的工艺稳定、合理、可行。
       【关键词】  鹿角托盘; 蛋白; 提取工艺
       Study on the Extraction Process of Proteins from Sika Antler Base
       YAO Baojin1， ZHAO Yu2*, NUI Fang2, HUANG Ping3, YANG Fei3, LI Juan1*
       (1. School of Public Health, Jilin University, Changchun 130021, China; 2. Center for New Medical Research of Changchun University of Chinese Medicine，Changchun 130117，China; 3. College of Traditional Chinese Materia Medica, Jilin Agricultural University, Changchun 130118, China)
       Abstract：ObjectiveTo establish the extraction process of proteins from Sika antler base. MethodsSDS-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE), was used to study the impacts on protein extraction, including pH values, solid-liquid ratio, extraction times, salt concentration and other factors. ResultsThe extraction process was obtained as follows: the materials were extracted twice with pH12 buffer solution in which contained 50 mmol/L EDTA and 0.5 mol/L NaCl, each time adding 5 times amount of buffer solution and extracting 3 h. ConclusionThe yield of proteins can be up to 2%, and purity can also be up to 80%. The optimum process obtained is steady, reasonable and feasible.
       Key words： Sika antler base;Proteins;Extraction process
       鹿角脱盘(Sika antler base)作为鹿产品的一种，是雄性梅花鹿Cervw nippon Temminck额骨上的角根与由此而生的鹿茸之间的平环状突起物，具有补肝肾、益脾胃、强筋壮骨、镇痛散癖、行血消肿、软坚散结、消除乳房痞块之功效，民间常用于治疗乳腺炎、恶疮、痈肿等[1]。
       目前，对于鹿角脱盘的化学成分及药理作用研究并不深入，在很大程度上限制了鹿角脱盘产品的开发。在前期工作中，我们对鹿角脱盘蛋白进行了质谱分析和数据库检索，表明鹿角脱盘蛋白含有多种活性蛋白，如抗菌肽Cathelicidin、肽聚糖识别蛋白等。本课题针对鹿角脱盘中的蛋白及多肽类成分进行分离纯化和鉴定，结合其临床应用进行药理和药效学研究，为鹿角脱盘产品的进一步开发和利用提供科学依据。本文报道为鹿角脱盘蛋白的提取工艺部分。
       1 仪器与材料
       梅花鹿鹿角脱盘，购自吉林省东风药业有限公司;三羟甲基氨基甲烷(Tris)、 十二烷基硫酸钠(SDS)、丙烯酰胺、甘油、甘氨酸购自Sigma公司;过硫酸铵(Ammonium Persulfate)、N,N,N",N"-四甲基乙二胺(TEMED)、β-巯基乙醇(β-Mercaptoethanol)、考马斯亮蓝 R250(Coomassie Blue R250)、溴酚蓝购自Amresaco公司;低分子量标准蛋白质(包括6种标准蛋白，相对分子质量分别为97.4 ，66.2，43.0，31.0，20.1，14.4kDa)，购于中国科学院上海生物化学研究所;其它试剂均为分析纯。
       TDL-5型台式大容量离心机(上海安亭科学仪器厂);CP225D型电子天平(北京赛多利斯仪器系统有限公司);DYY-8C型电泳仪(北京六一仪器厂);LL3000 型冷冻干燥机(德国Heto公司);高速离心机(Eppendorf公司);电泳仪、垂直板电泳槽(北京六一仪器厂)。
       2 方法与结果
       2.1 不同浸提pH值对蛋白提取效果的影响精密称取鹿角脱盘粉12份，每份300 mg。分别加入pH3.0，4.0，5.0，6.0，7.0，8.0，9.0，10.0，11.0，12.0的缓冲溶液，按料液比1∶10浸提，时间为3h，浸提次数为两次，提取温度4℃，6 000 r·min-1离心15 min，上清液合并，经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析，结果见图1由图1可知，当pH值为12时，提取出的鹿角脱盘蛋白条带最多。因此在浸提过程中选用pH值为12的缓冲溶液进行浸提。
       2.2 不同浸提料液比对蛋白提取效果的影响精密称取鹿角脱盘粉4份，每份300 mg。加入pH12的缓冲溶液浸提，料液比(W/V)分别为1∶5，1∶10，1∶15，1∶20，时间为3 h，浸提次数为两次，提取温度4℃，6 000r·min-1离心15 min，上清液合并，经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析。结果见图2由图2可知，料液比为1∶5和1∶10时提取出的鹿角脱盘蛋白条带最多，但差别并不明显，因此在浸提过程中选择料液比为1∶5。
       2.3 不同浸提时间对蛋白提取效果的影响精密称取鹿角脱盘粉5份，每份300 mg。加入pH12的缓冲溶液浸提，料液比1∶5，时间依次为3，6，8，12，24 h，时间为3 h，浸提次数为两次，提取温度4℃，6 000 r·min-1离心15 min，上清液合并，经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析。结果见图3。从左至右样品顺序依次为：Marker、pH3、pH4、pH5、pH6、pH7、pH8、pH9、pH10、pH11、pH12Marker分子量自上而下依次为：97.4 ，66.2，43.0，31.0，20.1，14.4 kDa
       图1 不同浸提pH值对蛋白提取效果的影响从左至右样品顺序依次为：Marker、料液比1∶5、1∶10、1∶15、1∶20Marker分子量自上而下依次为：97.4 ，66.2，43.0，31.0，20.1，14.4 kDa
       图2 不同浸提料液比对蛋白提取效果的影响从左至右样品顺序依次为：Marker、3、6、8、12、24 hMarker分子量自上而下依次为：97.4 ，66.2，43.0，31.0，20.1，14.4 kDa
       图3 不同浸提时间对蛋白提取效果的影响由图3可知，浸提时间长短对提取出的鹿角脱盘蛋白条带影响很小，因此在浸提过程中选择浸提时间为3 h。
       2.4 不同浸提盐浓度对蛋白提取效果的影响精密称取鹿角脱盘粉10份，每份300 mg。其中5份依次加入含EDTA 10，20，30，40，50 mmol/L的pH12的缓冲溶液浸提，另5份依次加入含NaCl 0.1，0.2，0.3，0.4，0.5 mol/L的pH12的缓冲溶液浸提，料液比为1∶5，时间为3 h，浸提次数为两次，提取温度4℃，6 000 r·min-1离心15 min，上清液合并，经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析，结果见图4由图4可知，随着EDTA浓度的增加，提取出的鹿角脱盘蛋白条带也越来越多，当达到50 mmol/L时提取效果最好，因此确定浸提时EDTA的浓度为50 mmol/L;随着NaCl浓度的增加，提取出的鹿角脱盘蛋白条带也越来越多，当达到0.5 mol/L时提取效果最好，因此确定浸提时NaCl的浓度为0.5 mol/L。
       综上所述，鹿角脱盘蛋白的提取工艺确定为：pH值12的缓冲液(含50 mmol/L EDTA、0.5 M NaCl)浸提，料液比为1∶5，浸提时间为3 h，浸提次数2次。
       2.5 验证试验称取鹿角脱盘粉3份，每份5 g，按上述工艺进行提取，经80%硫酸铵沉淀，透析后冻干，采用Bradford法测定蛋白含量，收率及纯度见表1表1 验证实验中蛋白的收率及纯度%
       3 讨论
       近年来，随着人们生活水平的提高和大众健康、保健意识的增强，对鹿角盘的化学成分、功能评价、药理作用等进行了一定的研究[2～4]。由于鹿角脱盘是鹿茸骨化后的产物，含有大量钙磷等化合物，构成了坚硬的结构，使得包含其中的蛋白等有效成分难以分离提取，直接影响了人们对它的研究。本实验考察了不同pH值、不同盐浓度、不同料液比等影响因素对鹿角脱盘蛋白提取效果的影响，确定了鹿角脱盘蛋白的提取工艺。由实验结果可以看出，当浸提缓冲溶液的pH为碱性时，鹿角脱盘蛋白的提取效果最高，由此证明鹿角脱盘中含有大量的酸性蛋白，因此在碱性条件下更易溶出。随着EDTA浓度的增加，蛋白的提取效果也随之增加，主要原因是由于鹿角脱盘为骨化组织，含有大量的钙离子，与蛋白质结合从而限制其溶解，加入EDTA可以络合钙离子，从而使蛋白释放溶解。在蛋白质水溶液中，加入少量的中性盐，如硫酸钠、氯化钠等，会增加蛋白质分子表面的电荷，增强蛋白质分子与水分子的作用，从而使蛋白质在水溶液中的溶解度增大，实验结果表明鹿角脱盘蛋白需在较高的盐浓度下才可溶解。
       【参考文献】
         　[1] 国家药典委员会. 中国药典，Ⅰ部[S]. 北京:化学工业出版社,2005 :225.
       
       [2] 张宝香，金春爱，赵延平. 鹿角盘的化学成分与开发利用[J]. 特种经济动植物,2005,12:7.
       
       [3] 王丽虹，高志光. 鹿花盘水溶性成分的药理活性与临床应用[J]. 经济动物学报，1999，3(3)：18.
       
       [4] 陈玉山，王振玉，王本祥. 鹿角脱盘注射液治疗乳腺增生的药理实验研究[J].生化药物杂志,1987,2:12.