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       【摘要】 
       目的建立解毒利尿颗粒中甘草酸含量的高效液相测定方法。方法采用DiamonsilTM C18柱(250mm×4.6 mm，5 μm)，以甲醇-[0.02 mol·L-1醋酸铵-冰醋酸(33∶1)](64∶36)为流动相，流速为1 ml·min-1;柱温30℃;检测波长250nm。结果甘草酸在0.15～0.75 μg范围内呈良好的线性关系(r=0.999 8)，该方法平均回收率为98.99%，RSD为1.74%(n=6)。结论该方法简便、稳定易行、准确、重现性较好，结果可靠，可为解毒利尿颗粒的质量评价提供有效依据。
       【关键词】  高效液相色谱法; 解毒利尿颗粒; 甘草酸
       Determination of Glycyrrhizic Acid in Jiedu Liniao Granules by HPLC
       DU Shushan1，ZHANG Zheng2，ZHANG Haiming1，SHEN Shengmin1，CAO Jie1，GUAN Ming2*
       (1.Protection and Utilization of Traditional Chinese Medicine of Beijing Area Major Laboratory，Beijing 100875，China; 2.Pharmacological College of Jilin University，Changchun 130021，China)
       Abstract：ObjectiveTo establish a method for determination of glycyrrhizic acid in Jiedu Liniao granules by HPLC. MethodsDiamonsilTM C18 column (5 μm,250mm×4.6 mm) was used with methol-(0.02 mol·L-1 ammonium acetate-glacial acetic acid(33∶1))(64∶36) as mobile phase.The flow rate was 1.0 ml·min-1，the column temperature was 30℃ and the detection wavelength was 250nm.ResultsThe calibration curve were linear within the range of 0.15～0.75 μg(r=0.9998).The average recovery rate was 98.99%(RSD=1.74%). ConclusionThe method is convenient,stable and accurate,so it can be used for determination of glycyrrhizic acid in Jiedu Liniao granules.
       Key words：HPLC; Jiedu Liniao Granules; Glycyrrhizic acid
       解毒利尿颗粒由生甘草、白茅根、赤芍、紫苏叶、生姜、猪苓等6味药材组成，具有清热解毒、利尿等功效，临床上主要用于不明原因的中毒，因本品具有减轻中毒症状的作用，可为临床诊断确定中毒原因提供时间。甘草为本复方制剂中的君药，甘草酸是该药的主要有效成分，具有抗炎、解毒、保肝和增强免疫等作用[1]，因此本实验以甘草酸为指标进行含量测定，对本品进行质量控制。
       目前，甘草酸的含量测定方法有高效液相色谱法[2]、薄层扫描法[3]和高效毛细管电泳法[4]和光纤近红外光谱法[5]等，因高效液相色谱法具有方法简便、稳定、重现性好等优点，故本研究采用此法测定解毒利尿颗粒中甘草酸的含量，旨在达到对本品进行质量控制的目的。
       1 仪器与试药
       Waters1525高效液相色谱仪(配Waters2487紫外可见检测器)，MeLLennium32色谱工作站;KQ-250DB数控型超声波清洗器(昆山市超声仪器公司);METTER Toledo AG135 1/10万电子分析天平(瑞士METTER公司)。
       甘草酸铵(中国药品生物制品检定所，批号：110731-200511)。解毒利尿颗粒样品(自制，批号：20060811，20060813，20060816)。甲醇为色谱纯，水为纯净水，其他试剂均为分析纯。
       2 方法与结果
       2.1 色谱条件 色谱柱为DiamonsilTM C18 (250mm×4.6 mm，5 μm);流动相为甲醇-[0.02 mol·L-1醋酸铵-冰醋酸(33∶1)](64∶36);检测波长250 nm;流速1.0 ml·min-1;柱温30℃。进样量10 μl。根据试验结果，考虑到仪器、色谱柱、流动相的配制和温度等系统因素的影响，规定理论板数按甘草酸峰计算，应不低于2 000。
       2.2 对照品溶液的制备精密称取在五氧化二磷干燥器中干燥至恒重的甘草酸铵对照品1.25 mg，置25 ml量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，即得(每毫升含甘草酸铵50 μg，相当于甘草酸48.975 μg)。
       2.3 供试品溶液的制备 取本品(批号20060811)5袋，粉碎，称取0.5 g，精密称定，置100 ml的量瓶中，加40%甲醇稀释至刻度，超声提取40 min，静置，取上清液，滤过，取续滤液，即得。
       2.4 阴性供试品溶液的制备 按解毒利尿颗粒的处方，取除甘草提取物外的其他辅料依照本品制备工艺制备阴性样品制剂。取阴性样品制剂0.5 g，精密称取，按供试品溶液的制备方法制得阴性供试品溶液。
       2.5 系统适应性试验 按供试品测定方法进行测定。结果表明，甘草酸对照品与解毒利尿颗粒中甘草酸的保留时间一致，阴性供试品溶液在甘草酸色谱峰位置处无相应的峰出现，同时与其他组分分离完全，分离度为2.04，理论板数按甘草酸峰计算应不低于2 000。结果见图1。
       2.6 线性关系考察 分别精密自动吸取此溶液3，5，8，10，13，15 μl，注入液相色谱仪，按上述色谱条件测定峰面积。以进样量X(μg)对峰面积的积分值Y进行线性回归，计算回归方程：Y=784 579X-19 762(r=0.999 8)，试验结果表明甘草酸铵进样量在0.15～0.75 μg范围内线性关系良好。
       A甘草酸铵对照品 B供试品 C阴性对照 1.甘草酸
       图1 HPLC图谱
       2.7 精密度实验精密注入对照品溶液10 μl，依法连续进样6次，测得甘草酸峰面积的RSD=1.82%，实验结果表明仪器精密度良好。
       2.8 稳定性实验取同一供试品溶液(批号：20060811)，按0，2，4，6，8，12 h时间间隔进样，分别测定峰面积，测定甘草酸的含量结果RSD为2.92%，表明供试品溶液在12 h内稳定，样品含量无明显变化，在此时间内测定供试品化学性质稳定。
       2.9 重复性实验取6份样品(批号：20060811)，同前法测定样品中甘草酸的含量，RSD为2.45 %，表明重现性良好。
       2.10 加样回收实验取已知准确含量的样品(批号：20060811，含量为125 mg/袋)6份，每份0.25 g，精密称定，置100 ml量瓶中。精密加入甘草酸铵对照品(2.483mg)，按样品测定方法进行测定，结果平均回收率为98.99%，RSD为1.74%，加样回收率均符合要求。结果见表1表1 加样回收率实验结果
       2.11 样品含量测定 按上述方法，测定3批解毒利尿颗粒中甘草酸的含量。结果见表2表2 样品每袋含量测定结果
       3 讨论
       3.1 提取方法的确定 文献报道，甘草酸的提取方法有溶剂提取法[6]、微波法[7]及超临界CO2流体萃取法[8]等。溶剂提取法提取时间长，杂质溶出率较高，工作量大;微波法虽提取时间短，提取率高，但是杂质溶出率高;超临界CO2流体萃取法快速、高效、选择性专一且无污染，但存在操作压强大，夹带剂浓度高，萃取时间较长，仪器设备昂贵等不足。超声提取法具有方便、快捷、提取效率高等优点，因此本试验采用此法对甘草酸进行提取。
       3.2 提取时间的确定取本品超声处理不同时间(20，40，60，80，100min)，分别测定其峰面积，结果发现超声提取40 min后，随提取时间延长峰面积不再增加。因此本试验中提取时间定为40 min。
       3.3 测定波长的选择解毒利尿颗粒样品及甘草酸铵对照品的光谱图表明，甘草酸铵在250 nm波长处有最大吸收，故将250 nm作为样品含量测定的检测波长。
       3.4 流动相的选择根据文献报道[9，10]，实验中曾采用乙腈-水-冰醋酸为流动相，改变不同比例，均未能达到较适宜的保留时间和分离效果;选择甲醇-醋酸铵-冰醋酸为流动相，调整比例后可以使保留时间适宜，使分离度和理论板数均符合要求。
       【参考文献】
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