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       【摘要】 
       目的观察赤雹果多糖对免疫抑制模型小鼠免疫功能的影响。方法采用环磷酰胺(CY)造模法制作小鼠免疫抑制模型，观察赤雹果多糖对实验动物免疫器官重量指数、碳粒廓清能力、迟发型变态反应(DTH)、溶血素(IgM)含量的影响。结果赤雹果多糖400，200 mg·kg-1剂量组能显著提高小鼠免疫脏器指数、单核巨噬细胞的吞噬功能及小鼠迟发型超敏反应, 促进溶血素的生成。结论赤雹果多糖有显著提高免疫抑制小鼠免疫功能的作用。
       【关键词】  赤雹果; 多糖; 免疫功能; 环磷酰胺
       Effects of Polysaccharide from the Fruit of Thladiantha dubia Bunge on the Immunefunctions of Immunosuppressed Mice
       ZHAO Bo, ZHANG Yuling, TONG Jiming*
       (Institute of Chinese Materia Medica,Chengde Medical College, Chengde,Hebei 067000 China)
       Abstract：ObjectiveTo observe the effects of polysaccharide from the fruit of Thladiantha dubia Bunge on the immune functions of immunosuppressed mice. MethodsImmunosuppressed mouse model was established by intraperitoneal injection with cyclophosphamide followed by daily intragastric administration of polysaccharide from the fruit of Thladiantha dubia Bunge. After the treatment, the mice were examined for immune organ weight index, carbon particle clearance capability of macrophage, delayed type hypersensitivity, serum IgM level following exposure to sheep erythrocytes.ResultsTreatment of the immunosuppressed mice with polysaccharide from the fruit of Thladiantha dubia Bunge at the daily dose of 400 and 200 mg·kg-1 significantly increased the weight of the immune organs, carbon particle clearance capability of macrophage,delayed type hypersensitivity, serum IgM level against erythrocytes. ConclusionThe polysaccharide from the fruit of Thladiantha dubia Bunge can enhance the immune functions of immunosuppressed mice induced by cyclophosphamide.
       Key words：Thladiantha dubia Bunge; Polysaccharide; Immune function; Cyclophosphamide
       赤雹果为葫芦科，多年蔓生草本植物赤雹Thladiantha dubia Bunge的干燥成熟果实[1]，广泛分布于华北、东北等地，具有理气、降逆、祛痰、止血等作用，民间用赤雹果水煎剂治疗腰腿痛、风湿痛、痛经、软组织扭伤等，疗效显著。前期研究显示赤雹果中富含多糖类成分，其水提物和醇提物具有显著的抗炎镇痛及抗过敏作用，且无明显的毒副作用[2，3]。
       多糖是多种中草药的有效成分，具有免疫调节、抗炎、抗肿瘤等多方面的药理活性[4]，赤雹果多糖的免疫增强功能可能是赤雹果抗炎机制的组成部分。本文考察了赤雹果多糖对免疫抑制模型小鼠免疫功能的影响，为赤雹果抗炎作用机制的研究及赤雹果的深入开发提供理论依据。
       1 材料与仪器
       1.1 动物昆明种小鼠，雌雄各半，体质量18～22 g，由河北医科大学实验动物中心提供，合格证号：903014。
       1.2 试药与仪器赤雹果，采自河北省青龙满族自治县(2008-10采集，由承德医学院中药研究所赵春颖副研究员鉴定为葫芦科植物 Thladiantha dubia Bunge的成熟果实，样本保存于承德医学院中药研究所)。三氯乙酸(天津大茂化学试剂厂);环磷酰胺(江苏恒瑞医药股份有限公司，批号：08120521);印度墨汁(CHROMA GMBH&CO)。绵羊红细胞(承德医学院动物中心提供);HP-8453紫外可见分光光度计(美国惠普公司);AG-245型电子分析天平(瑞士Mettler公司)。
       2 方法与结果
       2.1 赤雹果多糖的提取称取赤雹粗粉适量，置圆底烧瓶中，加入适量石油醚(60～90℃)回流提取1 h，滤过，滤渣挥干溶媒，以80%乙醇回流提取2次，1 h/次，滤过;滤渣置圆底烧瓶中，加入蒸馏水浸泡数小时后回流提取2次，1 h/次，滤过，两滤液合并;合并液浓缩至小体积，加入体积比为1∶1的5%三氯乙酸溶液，静置2 h后离心、过滤，滤液用95%乙醇调含醇量80%，放冰箱内(4 ℃)静置过夜，次日抽滤，滤渣以无水乙醇、丙酮、乙醚依次洗涤数次，得白色粉末样物质，60 ℃烘干，即得赤雹果多糖。
       2.2 实验动物分组与给药取小鼠200只，每个实验50只，随机分为5组，即正常对照组、模型组、赤雹果多糖高剂量组(400 mg·kg-1·d-1)、中剂量组( 200 mg·kg-1·d-1)和低剂量组(100 mg·kg-1·d-1，每组10只。各实验组均每天灌胃给药1次，正常对照组和模型组用等体积的0.9%生理盐水灌胃，连续16 d，于第15，16天灌胃给药的同时腹腔注射0.6%环磷酰胺，剂量为50 mg·kg-1，正常对照组腹腔注射等体积的生理盐水。
       2.3 小鼠免疫器官重量的测定[5]第2次腹腔注射0.6%环磷酰胺24 h后，称小鼠体质量, 颈椎脱臼处死小鼠，取脾脏、胸腺称其湿重，计算脾指数和胸腺指数。脾指数=脾重量(mg)/体质量(g);胸腺指数=胸腺重量(mg)/体质量(g)。结果见表1表1 赤雹果多糖对CY致免疫抑制小鼠免疫器官指数的影响
       2.4 单核巨噬细胞吞噬功能(碳粒廓清速率)的测定[6]第17天再给药1次，给药后1 h，称体质量，各鼠均按0.1ml·10g-1剂量由尾静脉注入印度墨汁(以生理盐水按1∶5稀释)，注射后分别在2 min(t1)、20 min(t2)从小鼠眼眶静脉丛取血20 μl，溶于2.0 ml的0.1%Na2CO3溶液中摇匀，放置20 min后于650 nm处测其吸光度值(A)，以0.1%Na2CO3溶液做空白对照，将小鼠处死后取肝脏和脾脏，用滤纸吸干血迹后称重，根据公式计算廓清指数K值和校正廓清指数α值。结果见表2计算公式：K=(logA1-logA2)/(t2-t1);α=K1/3×体质量/(肝重+脾重)
       2.5 小鼠血清溶血素的检测[7]第2次腹腔注射0.6%环磷酰胺24 h后，摘眼取血，放置1 h，离心，分离血清。血清用生理盐水稀释250倍，从中取1 ml加至反应管中，再加入0.5 ml的10%SRBC，加入补体1 ml(以生理盐水1∶10稀释过的豚鼠血清作为补体)，移至37 ℃恒温水浴锅中，保温30 min，取出后置冰浴中以终止反应，用2 000 r·min-1离心10 min，取上清液1 ml，加入3 ml都氏试剂混匀，10 min后在540 nm处进行比色，记录各样品的吸收值(OD)。另设10%SRBC0.25 ml，加4 ml都氏试剂，同法测出SRBC半数溶血吸收值，按照下列公式计算每个样品的半数溶血值(HC50 )。结果见表2表2 赤雹果多糖对CY致免疫抑制小鼠碳粒廓清及血清溶血素的影响
       2.6 对迟发型变态反应(DTH)的影响[8]第15，16天小鼠腹腔注射0.6%环磷酰胺后，每鼠腹腔注射2% SRBC 0.2 ml致敏，致敏后第4天，于小鼠右侧足垫皮下注射20%SRBC悬液50 μl, 左侧注射50 μl生理盐水，分别于3，24 h后用游标卡尺测定小鼠左右足趾厚度之差为肿胀程度。同一部位测量3次，取平均值。结果见表3表3 赤雹果多糖对CY致免疫抑制　小鼠迟发型变态反应(DTH) 的影响
       由表3可知，与模型组相比，赤雹果多糖400，200 mg·kg-1·d-1剂量组能显著增强SRBC攻击后3，24 h小鼠出现的肿胀反应，使CY抑制的反应趋于恢复正常，说明赤雹果多糖可增强CY所致免疫抑制模型小鼠的体液免疫和细胞免疫反应能力。
       3 讨论
       大量的药理和临床研究表明，多糖类化合物是一种免疫调节剂，它能激活免疫细胞，提高机体的免疫功能，而对正常细胞没有明显毒副作用[4]。临床所见的多种疾病多伴有免疫功能低下，本实验采用了免疫抑制小鼠模型观察赤雹果多糖的免疫调节作用，更加接近于临床应用。
       环磷酰胺(CY)是一种作用较强的免疫抑制剂，常用于制备免疫低下模型。本实验中，正常对照组和CY模型组实验指标差异具有统计学意义，说明成功制造出了免疫抑制小鼠模型。
       脾脏和胸腺是人体重要的免疫器官，两者相对重量的变化在免疫评价中占有重要的地位。赤雹果多糖组的脾脏和胸腺指数显著高于模型组，表明其能改善CY引起的脾脏和胸腺萎缩，对免疫器官有一定的免疫促进作用。
       单核巨噬细胞的吞噬能力是衡量机体非特异性免疫功能的标志之一。印度墨汁通过静脉注入小鼠血循环后，迅速被单核巨噬细胞所清除，主要被定居在肝脏和脾脏的巨噬细胞所吞噬，若印度墨汁量恒定，则从血流中清除的速率可反映单核巨噬细胞的吞噬功能。赤雹果多糖能够明显激活、增强CY所致免疫抑制小鼠单核巨噬细胞的吞噬功能，表明其对CY所致免疫抑制模型小鼠的非特异性免疫功能有增强作用。
       溶血素测定法是影响特异性免疫功能的实验方法之一。由于致敏小鼠血清中的抗体——溶血素(IgM)，与绵羊红细胞一起体外温育，在补体参与下，可产生溶血反应，而血清中溶血素的含量可通过溶血过程中释放的血红蛋白来检测，用分光光度计比色测定。赤雹果多糖能明显增加CY所致免疫抑制模型小鼠血清溶血素含量，拮抗CY所致的体液免疫抑制，说明赤雹果多糖能够提高其体液免疫能力。
       在SRBC诱导的DTH模型中，一般认为SRBC攻击后3 h正常小鼠出现的肿胀反应是由特异性抗体介导的反应，攻击后24 h出现的肿胀反应则是T细胞介导的反应[9],它们分别反应了体液免疫和细胞免疫反应的状况。赤雹果多糖高、中剂量组能显著增强SRBC攻击后3，24 h小鼠出现的肿胀反应，表明其具有增强小鼠体液免疫和细胞免疫反应的能力。
       赤雹果中富含多糖类成分，植物赤雹药源丰富、易于种植，具有巨大的研究价值与应用前景。
       【参考文献】
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